NYT 553-2015 禽支原体PCR检测方法.pdf

ICS11.220
B 4
中华人民共和国农业行业标准
NY/T553-2015
代替NY/"T553-2002
禽支原体PCR检测方法
Detection of avian mycoplasmas
by polymerase chain reaction(PCR)
2015-05-21发布
2015-08-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T553-2015
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。
本标准代替NY/T553-2002《禽支原体病诊断技术》。
本标准与NY/T553-2002相比,删除了血清凝集实验,选取了PCR方法检测鸡毒支原体和滑液
囊支原体。
本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181归口。
本标准起草单位:中国动物卫生与流行病学中心。
本标准主要起草人:王娟、李卫华、王玉东、黄秀梅、龚振华、郭福生
本标准的历次版本发布情况为:
NY/T553~-2002
NY/T553-~-2015
禽支原体PCR检测方法
1范围
本标准规定了禽支原体PKR(聚合酶链式反应)的檢测技术要求。
本标准适用于禽支原体病的流行病学満查和辅助性诊断
缩略语
下列缩略语适用于本文件
MG: m ycopla sme ga/lise indicum鸡毒支原体
MS: mycopla smma synoviae滑液囊支原体。
PBS: phos phate buffered soiution酸盐冲液。
3实验室设备要求
3.1仪器
基因序列分析仪、台式高速冷冻离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外凝胶成像系统、微量移液器、水
浴锅、涡旋仪等。
3.2操作区域
样品处理区要有相应的生物安全设施;配液区要求高度洁净;电泳区要与其他操作区域相互隔离
3.3操作者
操作者应接受过PCR技术培训,熟悉防止梭酸污染和溴乙锭污染的具体措施,熟悉电泳结果的判
断方法
4相关试剂
4.12× Tag Master Mix
生物试剂公司生产。
4.21.5%琼脂耱凝胶
见A.1
4.31×TAE緩冲液
见A.2。
4.4溴乙锭(10ug/ML)
见A.3。
4.5商品化的DNA分子量标准
要求在100bp~300bp之间有5条以土的指示条带。
4.6标准菌株
S6株、WVU1853株购自中国兽医药品监察所
4.7阴性对照品
用高压灭菌的PBS作为阴性对照标准
操作程序
样品处理
NY/T553~-2015
将气管拭子、关节囊穿刺液、关节拭子样品悬浮于1 ML PBS溶液中,混匀成悬浮液;气管、肺、气囊
等组织器官充分研蘑后,加入适量的PBS溶液,制成混悬液,备用;也可用分离培养后的菌液作为样品。
5.2DNA提取
将制成的悬浮液或悬液2000r/min离心5min,将离心后的上清或分离培养后钓菌液置于1.5mL
带盖的微最离心管中,在4℃条件下,14000g离心30min。用微量加样器仔细除去上清液,并将沉淀悬
浮于25L.双蒸水中。将置于离心管中的内容物隔水煮沸10min,然后冰浴10in,14000g高心
10min,上清液为DNA模板,用于扩增其16 S TDNA。
5.3引物
5.3.1MG引物序列
MG-14F5-GAG CTA ATC TGT AAA GTTGTC-3
MG-13R:5′- GCT TCC TTG CGG TTA GCA AC-3。
5.3.2MS引物序列
MSF.5-GAG AAG CAA AAT AGT GAI ATC A-3
MS R.5-CAGTCG TC CCGAAG TIA ACA A-3
5.4PCR反应体系
25 HL PCR反应体系包括
ddh,(
DNA模饭
上、下游引物混合物
每次试验应设阳性对照和阴性对照。
先94℃变性5min,然后按94℃変性30s、55℃退火30s、72℃延伸60s的顺序循环,共循环35次,
最后在72℃温度下延伸10min,于4℃保存,备用
5.5PCR产物电泳
PCR反应结束后,每个PCR管中加入5L加样缓冲液,充分混」,再每管取5gL加人琼脂糖凝胶
板的加样孔中,在位于凝胶中央的孔加入DNA分子量标准。加样后,按照5V/cm电压,电泳20min
40min(每次电泳时,每隔10mn观察1次。当加样緩冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下2/5处时,可停
止电泳〉。电泳后,置于紫外凝胶成像仪下观察,用分子量标准判断PCR扩増产物大小
6结果判定
阳性对照出现相应大小的扩増条带且阴性对照无此扩増带时,判定检测有效;否则判定檢测结果
无效,不能进行断。
MG的PCR产物为185bp。如果在阳性对照出现185bp扩增带,阴性对照无带出现(引物二粲体
除外)时,试验成立。被检样品出现185bp扩增带为MG阳性,否则为阴性。
MS的PCR产物为207bp。如果在阳性对照出现207bP扩增带,阴性对照无帯出现(引物二聚体
除外)时,试验成立。被检样品出现207bp扩增带为MS阳性,则为阴性。