nyt 553-2002 禽支原体病诊断技术.pdf

ICS11.220
B41
中华人民共和国农业行业标准
NY/T553-2002
禽支原体病诊断技术
Diagnostic techniques for avian mycoplasmosis
mycoplasma gallisepticum)
2002-08-27发布
2002-12-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T553-2002
前言
禽支原体病( avian mycoplasmosis)又称鸡败血支原体( mycoplasm gallisepticum,简称MG),常引
起鸡的慢性呼吸道疾病。MG也可感染火鸡,引起传染性窦炎。世界动物卫生组织[ world Organization
for Animal Health(英), Office International des Epizooties(法),OIE]将本病例B类动物疫病,我国将
其列为二类疫病
本标准规定的方法与OE《诊断试验与疫苗标准手册》推荐相应方法一致。
本标准的附录A为规范性附录
本标准由农业部畜牧兽医局提出
本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。
本标准起草单位:农业部动物检疫所。
本标准起草人:郭福生、尹燕博、蒋正军、孙淑芳、陆明哲、龚振华。
NY/T553-2002
禽支原体病诊断技术
1范围
本标准规定了禽支原体(MG)分离鉴定和快速血湳凝集试验(RS.A)的技术要求
本标准适用于鸡和火鸡及其产品MG的检测
2禽支原体的分离和鉴定
2.1材料准备
2.1.1培养基制备见附录A(规范性附录)。
2.1-2兔抗MG阳性血清和抗免荧光抗体结合物。
2.2分离
2.2.1采样
活禽从鼻腔、食管、气管、泄殖腔和交合器中取样。死禽从鼻腔、眶下窦、气管或气衰采样,也可吸取
下窦和关节渗出物或结膜囊内冲洗物。对于鸡胚从卵黄囊内表面、口咽和气衰采样。
2.2.2样品的处理
采样后应尽快培养。如须运输,小块组织置于支原体培养基中,拭子在培养基中用力搅拌数次,将培
养基运回实验室尽快培养。
2.2.3接种
将样品0.2mIL.接种于1.8mI.支原体液体培养基中,依次10倍稀释至10-3,密封,37C培养。同时
将样品接种于支原体固体培养基中,置于含5%~10%二氧化碳(CO2)培养箱中培养。
2.2.3.1每天检査液体培养基酸碱度,一旦发现pH值变化,立即接种于固体培养基中培养。若培养基
酸碱度没有变化,毎隔3d~5d盲传一代,共传3代,培养10d后接种于固体培养基上培养
2.2.3.2固体培养基上若有薗落生长,用低倍显徽镜观察菌落,可见中央突起呈荷包蛋样(有时不典
型),需进…步作血清学鉴定。
2.3整定
2.3.1用间接荧光抗体试验(IFA)鉴定MG。取1,0cm~1.5cm的琼脂块,茵落面朝上置于载玻片
上,第一块载玻片上放一块待检分离物、一块已知MG菌落(S或R株)、一块已知其他支原体菌落,第
二块载玻片上放一块待检分离物。
2.3.2第一块载玻片上每块琼脂块上加一滴适当稀释的兔抗MG血清,第二块载玻片上琼脂块上加
一滴正常免血清。
2.3.3琼脂块在湿盒中室温条件下反应30min后,分别放到含有礴酸盐缓冲液(PBS)(pH7.2)的不同
器皿中,冲洗10min,共冲洗2次。
2.3.4将琼脂块放回原玻片,吸水纸吸取过多的水分,每块琼脂加上稀释好的抗兔荧光抗体结合物,反
应、洗涤同前,最后将琼脂块放回玻片,吸干多余水分后デ人射式荧光显徽镜下检査结果。
2.4结果判定
菌落呈现亮绿色荧光时为阳性反应,若仅有暗淡的菌落轮廊,与背景荧光颜色差别不大为明性。其
他已知支原体菌落、第二块载玻片分离物为阴性;第一块载玻片分离物、与己知MG菌落为阳性结果
时,证明分离物为鸡毒支原体。
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3快速血清凝集试验(RSA)
3.1从鸡群采集的血清样品,如不能立即进行试验,应4C保存,不能冻结。
3.2试验用染色抗原、阳性及阴性对照血清。
3.3操作方法:室温中加一滴(20gI)血清于白瓷板或玻板上,再加等量染色抗原,用棉签或火柴棒将
其混合,轻轻摇动玻板使之混合均匀。试验设阳性血清及阴性血清对照。
3.4结果判定:室温条件下,56c30min处理后的鸡血清2min内,火鸡血清3min内判定结果。规定
时间内,发生完全凝集的,判为阳性。如仅在液滴边缘部分出现凝集,或超过2min(火鸡3min)在边缘
出现凝集,判为可疑。超过规定时间无凝集者,判为阴性。
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附录A
规范性附录)
支原体培摹的制备
A.1支原体肉培养
A.1.1新鲜酵母浸出液的制备:称取250g具有活性的鲜酵母,悬浮于100mL蒸馏水中,加热至沸
点,冷却。3000r/min离心20min,倾出上清液,用0.1mol/L氢氧化钠(Na(H)调pH至7.8~8.0。过
滤除菌,置4C保存备用。
A.1.2甲液:不含结晶紫的支原体(PPLO)肉汤培养基( Difco)14.7g?加蒸馏水或去离子水700mL。
A.1.3乙液:猪血清(56℃灭活30min)150mL,质量浓度为25%新鲜酵母浸出液100mL,质量浓度
为10%葡萄糖溶液10mL,质量浓度为5%乙酸铊10mL,200000IU/mlL青莓素G5mL,质量浓度为
0.1%酚红2m[。将以上各种成品混合即乙液(也可用俵牛血清或马血清代替猪血消)。
将甲液经121kPa灭菌15min,冷却后加人乙液调pH值至7.8,即为支原体肉汤培养基
A.2支原体固培养基
取不含支原体生长抑制物的纯琼脂10g,加入到上述甲液中,混合后如前所述高压灭菌,置56℃水
浴中。然后加入乙液,小心混匀,避免产生气泡,然后倒人平皿中厚度约0.4cm,冷却后备用。
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