NYT 1186-2006 猪支原体肺炎诊断技术.pdf

ICS11,220
B41
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1186--2006
猪支原体肺炎诊断技术
Diagnostic techniques for swine mycoplasmal pneumonia
2006-07-10发布
2006-10-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T1186-2006
前言
猪支原体肺炎又称猪喘气病,是由猪肺炎支原体引起猪的一种接触性传染病,是造成养猪业经济损
失最重要的疾病之一。本病以咳嗽和气喘为主要临床特征,病变部位主要在肺部,可见心叶、中间叶和
尖叶有融合性支气管肺炎变化。本病广泛流行于世界各地,欧洲、亚洲、美洲、非洲以及大洋洲等主要养
猪国家和地区均有发生。
本标准的附录A为规范性附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标淮由全国动物防疫标准化技术委员会归口。
本标准起草单位:农业部动物检疫所、西北农林科技大学。
本标准主要起草人:郑增忍、张衍海、王娟、张彦明。
NY/T1186-2006
猪支原体肺炎诊断技术
范围
本标准规定了猪支原体肺炎的病原分离和鉴定及间接血凝试验技术。
本标准适用于猪支原体肺炎的诊断。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有
的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。
GB4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂
3临床诊断和病理学检查
3.1临床症状
猪支原体肺炎是一种发病率高死亡率低的慢性呼吸道传染病,主要临床症状为慢性干咳。新发病
猪群常星急性,张口喘气,痉挛性阵咳,死亡率30%左右。体温升高不明显。咳持续几周或甚至数
月,育肥绪咳嗽最严重。部分患猪呈腹式呼吸,嘴息沟明显。食欲减退,消瘦,背毛粗糙,生长停滞,病程
主要分急性、慢性两种类型。
3.2病理变化
主要病变见于肺、肺门淋巴结和纵隔淋巴结。急性死亡患猪肺有不同程度的水肿和气肿。肉眼病
变类似于膨胀不全的肺,尤其在疾病的慢性阶段。特征性病变是两肺的心叶、尖叶和膈叶前缘发生对称
性的实变,肺门淋巴结肿大。肺中间叶实变,以及肺门淋巴结肿大、増生,病变最初为票粒大至豆大呈均
匀的散布,逐渐扩展而融合成支气管肺炎。病变部界限明显,灰白色、无弹性,“胰样”、“鱼肉样”。切开
时,内有大量泡沫。其他器官无明显变化
3.3病理组织学检查
典型病变组织通过用常规的病理切片、染色、脱色后观察,支气管和细支气管上皮组织纤毛数量减
,小支气管周围的肺泡扩大,泡腔充满多量炎性滲出物,肺泡间组织有淋巴样细胞増生。急性病例中
扩张的泡腔内充满浆液性渗出物,杂有单核细胞,中性粒细胞,少量淋巴细胞和脱落的肺泡上皮细胞。
慢性病例,其肺泡腔内的炎性渗出物中,主要是淋巴细胞浸润。
3.4X线检查
X线检查对本病的诊断有重要价值,对可疑患猪进行Ⅹ线透视,可作出诊断。在X线检查时,猪只
以直立背胸位为主,侧位或斜位为辅。病猪在肺野的内侧区以及心膈角区呈现絮状及片状阴影,且肺纹
理清晰。
4病原分离和鉴定
4.1材料准备
4.1.1培养基
4.1.1.1A2肉汤:制备方法见附录A.1
4.1.1.2固体培养基:制备方法见附录A.2。
NY/T11862006
4.1.1.3厌气肉肝汤:制备方法见附录A,3。
4.1.1.4血琼脂平板:按GB4789,28的方法配制。
4.1.2其他材料
4.1.2.1灭菌棉拭子。
4.1.2.2Hank's液:配制方法见附录A.4。
4.1.2.30.25%鸡红细胞液
4.2病料采集
4.2.1活体病料采集:用棉试子深擦病猪的喉头或鼻腔,采集呼吸道分泌物。
4.2.2死后病料采集:无菌操作采取具有特征的病肺与健肺连接处的肺组织。
4.3病原分离
将病肺组织剪成2mm3以下的碎块,浸入 Hank's液中洗涤,除去血液和组织碎块,取3块~5块浸
泡在盛有5mLA26肉汤的试管中;棉拭子浸入约10mLA26肉汤中清洗,并压出棉花中残液,再经0.45
1m的滤膜过滤除菌,将滤液分装于试管。将上述试管置于含5%-10%CO2环境或用胶塞塞紧管口,
在37℃进行培养。1代~3代分离时须每经3d~5d,以20%的接种量连续进行移植;至4代~5代以
后,再经5d~7d连续转移以提高分离率。同时应设厌气肉肝汤、血琼脂平板作为细菌检查的对照
通过连续继代,当培养物出现有规则的变化时,应涂片镜检;同时将液体培养物作适当稀释后再接
种于固体培养基上,在含5%~10%CO2的环境中37℃培养3d~10d。培养时应逐日在低倍镜下观
察,若出现圆形、边缘整齐、似露滴状、中央有颗粒、稍隆起的小菌落,判为可疑菌落,需进一步进行鉴定。
4.4病原鉴定
4.4.1溶血试验
挑取可疑菌落接种于含猪或鸡红细胞的固体培养基上培养2d~3d,如为猪肺炎支原体,则菌落周
围无溶血现象。
4.4.2精氨酸利用试验
挑取可疑菌落接种于含精氨酸及酚红指示剂的液体培养基中,由于猪肺炎支原体不能分解精氨酸
产生氨,故指示剂不变色,试验为阴性。
4.4.3薄膜和斑点形成试验
挑取可疑菌落接种于含马血清的固体培养基上,由于猪肺炎支原体不能分解其中的脂肪酸,故在固
体培养基上菌落的表面和周固不能形成薄膜和斑点。
4.4.4红细胞吸附试验
将0,25%鸡红细胞液滴加于可疑菌落上,静止后弃去红细胞液,用生理盐水冲洗2次~3次,用低
倍镜检查,如为猪肺炎支原体可见菌落表面和周围吸附有大量红细胞。
4.4.5结果判定:以上实验皆为阳性者判为猪肺炎支原体。
间接血凝试验
5.1材料准备
5.1.196孔(12×8)V型(110°)有机玻璃反应板、25L微量移液器、微量振荡器等。
5.1.2猪肺炎支原体纯化灭活抗原、阳性血清、阴性血清。
5.1.3敏化红细胞:为猪肺炎支原体纯化灭活抗原致敏的雄性绵羊红细胞。
5.1.4稀释剂:含1%健康兔血清pH7.2PBSa
5.2操作方法
5.2.1血清的处理:取被检血清0.2mL于无菌小试管中,56℃水浴30min灭活,冷却后加入0.3mL