GBT 31798-2015 油菜黑胫病菌检疫鉴定方法.pdf

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资源描述
ICS65.020.0
B16
中华人民共和国国家标准
GB/T31798--2015
油菜黑胫病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Plenodomus biglobosus
(Shoemaker& H.Brun) Gruyter, Aveskamp Verkley
2015-07-03发布
2015-11-27实施
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会
发布
GB/T31798-2015
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归ロ。
本标准起草单位:中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共
和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、华中农业大学。
本标准主要起草人:赵晖、王振华、曾完东、易建平、李彬、李国庆、吴品珊、蔡翔。
GB/TI31798--2015
油菜黑胫病菌检疫鉴定方法
范围
本标准规定了油莱黑胫病菌( Plenodomus biglobosis)的检疫鉴定方法。
本标准适用于油菜种子、植株及其产品中油菜黑胫病菌的检疫和鉴定。
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
仪器设备和主要试剂
3.1仪器设备
生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成
像系统、电泳仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、涡旋振荡器
3.2主要试剂
除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂,试验用水符合GB/T6682
3.2.11%次氯酸钠
3.2.2DNA提取试剂:DNA提取试剂盒,异丙醇,无水乙醇。尿素提取液(7mol/ L Urea、50mmol/L
Tris HCI PH8.0、62.5mmol/ L NACI、1%SDS)蛋白酶K(20mg/mL),苯酚:三氯甲烷:异戊醇
(25:24:1)溶液,3mol/L. NAAC(PH5.2)。
3.2.3PCR试剂:10×PCR缓冲液(含25mmol/ L Mgso1),Taq酶, DNTPS。
3.2.4凝胶电泳试剂:琼脂糖,TAE, Ioading缓冲液,EB。
3.2.520%V8培养基:V8蔬菜汁( Campbell Soup公司)200mL,CaCO0.75g,琼脂粉13.0g,蒸馏
水定容至1000mL,调整pH至5.8,121℃高压灭菌20min
3.2.6马铃響葡萄糖琼脂培养棊(PDA):马铃響浸粉5.0g,葡萄糖20.0g,氯霉素0.1g,琼脂13.0g,蒸
馏水定容至1000mL.调整pH至5.6.121℃高压灭菌20min
病菌的鉴定
4.1症状检查
4.1.1种子症状检查
取样品量1%~5%(若样品少可适量増大比例)的种子,在解剖镜下挑选皱缩、干瘪、变色、残缺的
种子或有霉变的籽粒或病残体,每份种子样品挑选不少于500粒,用做病原菌的分离。另取1kg种子,
GB/T31798-2015
用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛,取筛上物、筛下物和种子各1g~2g用于DNA提取
植株症状检查
取病变的植株的茎根部和叶部进行检査。主要检査茎根部和叶部。选取叶片上出现圆形或不规则
形、稍凹陷、中部灰白色病斑、部分斑内散生许多小黑点症状的病变部位。植茎则选取不规则形淡褐色
斑,或灰白色病斑、稍凹陷、上生黑色小点,或茎基及根系溃疡、祜萎症状的病变部位(参见附录A)。
4.2分离培养
4.2.1种子病原菌的分离培养
将挑选的疑带菌种子置于灭菌蒸馏水中室温浸泡处理1d,转入-20℃下冷冻处理1d,1%次氯
酸钠消譯5min~7min,无菌水洗涤3次后,用滤纸吸干种子,按25粒/皿置于V8培养基或PDA培养
基上,在20℃~25℃.12h黑暗/12h光照(12h光暗交替)条件下培养,第3天开始观察
4.2.2植株病原菌的分离培养
用解剖刀取植株病健交界处的组织,剪成约0.4cmX0.4cm小段,用1%的次氯酸钠溶液消
5min,无菌水洗涤3次,灭菌滤纸吸干水分后置于V8脂培养基或PDA培养基上,同6.2.1培养观察。
4.3鉴定特征
该病菌在培养基上可良好生长,气生菌丝发达,产孢量大。后期(15d可见到明显的孢子座和粉红
色的孢子溢出。气生菌丝呈白色或微黄,后期菌丝上会分泌出淡黄棕色的油状液滴。分生孢子呈长杆
形或梭形,长度在2.5gm~3.0m之间,宽度在0.8m~1.1gm之间。在孢子的两端各有一个透明的
小液滴。PDA培养基会随着菌丝的生长呈黑色或黄色。该病菌在PDA上产生黄褐色色素。
4.4PCR检测
4.4.1样品DNA提取
取筛上物、筛下物和种子,或植株可疑病变组织各1g~2g,液氮研暦后各取样0.1g~0.2g,采用
商业化试剂盒或尿素法提取DNA(参见附录B)。
4.4.2PCR检测方法
PCR检测方法参见附录C.重复3次。用油菜黑胫病菌(Plen. bi globosus)参照菌株DNA作阳性
对照,用灭菌蒸馏水作空白对照。
结果判定
病菌的分离培养形态特征符合4.3中描述,可报告检出油菜黑胫病菌。PCR检测作为筛选和辅助
方法。
6样品保存与结果记录
6.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出油菜黑胫病菌的样品应保存于4℃冰箱中,以备复
核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。
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