DB15_T 3362-2024 瘤胃微生物体外培养操作规程.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 44 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 33622024 瘤胃微生物体外培养操作规程 The code of practice of in vitro culture protocol of rumen microbes 2024-02-23 发布 2024-03-23 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 33622024 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。本文件主要起草人：李胜利、孙海洲、金鹿、张春华、王博、张崇志、萨初拉、刘威、杨鼎、宝华、付乐、李文婷。DB15/T 33622024 1 瘤胃微生物体外培养操作规程 1 范围 本文件规定了瘤胃微生物体外培养的规程。本文件适用于反刍动物瘤胃微生物体外培养。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 HJ 536 水质 氨氮的测定 水杨酸分光光度法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 试剂和材料 试剂 4.1.1 本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB/T 6682 规定的一级水。4.1.2 氯化钙 CaCl22H2O。4.1.3 氯化锰 MnCl24H2O。4.1.4 氯化钴 CoCl26H2O。4.1.5 氯化铁 FeCl36H2O。4.1.6 碳酸氢铵 NH4HCO3。4.1.7 碳酸氢钠 NaHCO3。4.1.8 磷酸二氢钠 NaH2PO42H2O。4.1.9 磷酸二氢钾 KH2PO4。4.1.10 硫酸镁 MgSO47H2O。4.1.11 刃天青 C12H6NNaO4。4.1.12 硫化钠 Na2S9H2O。4.1.13 氢氧化钠 NaOH。试剂配制 4.2.1 瘤胃缓冲液的配制 DB15/T 33622024 2 4.2.1.1 营养元素溶液 A 准确称量氯化钙13.20 g，氯化锰10.00 g，氯化钴1.00 g，氯化铁8.00 g，溶解后定容到100 mL。4.2.1.2 缓冲溶液 准确称取碳酸氢铵4.00 g，碳酸氢钠35.00 g，溶解后定容至1000 mL。4.2.1.3 营养元素溶液 B 准确称取磷酸二氢钠5.70 g，磷酸二氢钾6.20 g，硫酸镁0.60 g，溶解后定容到1000 mL。4.2.1.4 刃天青溶液 将100 mg刃天青溶解到100 mL水中。4.2.1.5 还原剂溶液 需要现配现用，称取硫化钠0.336 g，1M 氢氧化钠2.0 mL，加入47.5 mL水。5 仪器和设备 实验室用植物样品粉碎机，筛网孔径 16 目32 目。分析天平，感量 0.0001 g。干燥箱：RT+10 250，控温精度5。ANKOM RFS 体外产气测量系统：模块数量 18 个以上，250 mL 培养瓶。震荡培养箱（数显水浴震荡培养箱或气浴震荡培养箱）：内径大于 30 cm40 cm，震荡频率 0 r/min100 r/min，控温范围 室温至 99.9，温控精度0.1。pH 计：测量范围 014，精度0.1。6 操作步骤 培养底物的制备 按照GB/T 14699.1制备培养底物，置于干燥箱内65 烘干，粉碎或研磨后过16目筛，混匀后取100 g200 g装入磨口广口瓶内或封口袋内，保存备用。瘤胃缓冲液配制 取营养元素溶液A 0.12 mL、缓冲溶液237 mL、营养元素溶液B 237 mL、刃天青溶液1.22 mL加入到474 mL水中，通入CO2至饱和，并保存在39 水浴恒温培养箱中，最后再加入49.5 mL还原剂溶液，加水定容至1000 mL，继续通入CO2直到溶液由蓝色变成无色。瘤胃液的制备 选择健康、体重接近的3只（头）装有永久性瘤胃瘘管的供试动物，单栏饲养。在晨饲前经瘤胃瘘管利用瘤胃液取样器采集供试动物的瘤胃液，每只（头）动物采集150 mL200 mL,转入预热至39 的保温容器中。用搅拌器搅拌2 min，混合均匀后经4 层纱布过滤，同时通入CO2气体，备用。培养装置的准备 DB15/T 33622024 3 每个培养瓶中加入培养底物约0.5 g（准确至0.0001 g），每种培养底物设3个重复，每次培养设1个空白（只有培养液无底物）。保持所有培养瓶为39.5，每个培养瓶加入40 mL缓冲溶液，pH调整至6.8，调节缓冲平衡20 min30 min。培养 每个培养瓶中迅速加入20 mL瘤胃液。瘤胃培养液通入CO2 3 min，立即拧上瓶盖，放入39.5 培养箱内培养，培养箱的震荡频率为15次/分，持续培养48 h。7 瘤胃微生物体外培养参数测定 瘤胃微生物体外培养参数测定见附录 A，包括产气量的记录、pH 值测定、氨氮和挥发性脂肪酸的测定和营养物质消失率的测定。DB15/T 33622024 4 A A 附录A （资料性）瘤胃微生物体外培养评价参数测定 A.1 瘤胃微生物体外培养的操作 瘤胃微生物体外培养的操作包括6个步骤见图A.1，在瘤胃微生物体外培养过程中进行产气量的记录，培养完成后，可以进行pH值测定、氨氮和挥发性脂肪酸的测定和营养物质消失率的测定。A.2 体外培养参数 A.2.1 产气量的记录 利用产气测量系统每隔60 s记录产气模块内的气体压力变化，最后由样品模块内压力减去空白模块内压力得到，计算出0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h、12 h、16 h、18 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h各时间点的产气量。A.2.2 pH值测定 发酵至48 h时，打开培养瓶采集培养液样品10 mL，立即用pH计测定培养液pH值。pH值的适宜范围为5.76.8。A.2.3 氨氮和挥发性脂肪酸的测定 取20 mL上清液用4层纱布过滤后，置于-20 冰箱保存备测氨氮和挥发性脂肪酸。氨氮按照HJ 536进行测定，挥发性脂肪酸采用气相色谱法测定。A.2.4 营养物质消失率的测定 取剩余培养残渣烘干后，测定相关营养物质的含量，计算营养物质的消失率。（A.1）式中：Y 代表试样中某一营养物质的消失率，单位为百分比（%）；W1 培养底物中某一营养物质含量，单位为克（g）；W2 残渣中某一营养物质含量，单位为克（g）。A.3 重复 每个培养底物称取三个平行样进行测定，取平均值为分析结果，同一样品平行测定结果的偏差不应超过算术平均值的 10%。DB15/T 33622024 5 图A.1 瘤胃微生物体外混合培养操作规程流程图 瘤胃液的制备（见 6.3）培养装置的准备（见 6.4）产气量的记录（见 A.2.1）瘤胃缓冲液配制（见 6.2）培养底物的制备（见 6.1）pH 值测定（见 A.2.2）氨氮和挥发性脂肪酸的测定（见A.2.3）营养物质降解率的测定（见 A.2.4）培养（见 6.5）瘤胃微生物体外培养参数测定（见 7）