T_PSC 1.3-2022 船舶压载水检测方法 第3部分：大肠埃希氏菌.pdf

ICS 13.060.01 CCS Z17 团体标准 T/PSC 1.32022 船舶压载水检测方法 第 3 部分：大肠埃希氏菌 Determination for ballast water of shipsPart 3:Escherichia coli 2022-01-01 发布 2022-07-01 实施 中国太平洋学会 发 布 T/PSC 1.32022 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 方法原理.1 5 试剂和材料.1 6 仪器与设备.2 7 样品采集.2 8 样品检测.2 9 结果计算与表示.3 10 质量保证和控制.3 11 废物处理.3 附录A （资料性）97 孔定量盘结果检索表.4 附录B （资料性）检测结果记录表.8 参考文献.9 T/PSC 1.32022 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件为T/PSC 12021 船舶压载水检测方法 的第3部分，T/PSC 12021已经发布了以下部分：船舶压载水检测方法 第1部分：大于等于50 m活体生物；船舶压载水检测方法 第2部分：大于等于10 m且小于50 m活体生物；请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中国太平洋学会东海环境分会提出。本文件由中国太平洋学会归口。本文件起草单位：上海海洋大学、国家海洋局东海环境监测中心、国家海洋局东海标准计量中心。本文件主要起草人:吴惠仙、王琼、何勇、薛俊增、袁林、徐超群、葛春盈。T/PSC 1.32022 1 船舶压载水检测方法 第 3 部分：大肠埃希氏菌 1 范围 本文件规定了测定船舶压载水大肠埃希氏菌的酶底物法。本文件适用于船舶压载水大肠埃希氏菌的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 17378.4 海洋监测规范 第4部分：海水分析 IMO MEPC.300(72)：2018 压载水管理系统认可规则（Code for approval of ballast water management systems(BWMS CODE)）IMO BWM.2/Circ.42/Rev.2：2020符合BWM公约和G2指南要求的压载水取样和分析试验指南（Guidance on ballast water sampling and analysis for trial use in accordance with the BWM Convention and Guidelines(G2)）3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 方法原理 在特定温度下培养特定的时间，大肠埃希氏菌能产生-半乳糖苷酶，将选择性培养基中的无色底物邻硝基苯-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)分解为产物邻硝基酚（ONP），呈黄色反应。同时，大肠埃希氏菌能产生-葡萄糖醛酸酶，将选择性培养基中的无色底物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)分解为4-甲基伞形酮，在366 nm紫外灯照射下产生特征性荧光。统计黄色且荧光反应出现的孔格数量，查97孔定量盘结果检索表（附录A），计算样品中大肠埃希氏菌的浓度值。5 试剂和材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水，GB/T 6682，二级，使用前经 121 高压蒸汽灭菌 20min。市售 Colilert 培养基或其他等效产品。市售 Colilert-18 培养基或其他等效产品。标准阳性比色盘。生理盐水：0.85%氯化钠溶液，使用前经 121 高压蒸汽灭菌 20min。阳性对照标准菌株：大肠埃希氏菌有证标准菌株。T/PSC 1.32022 2 阴性对照标准菌株：铜绿假单胞菌有证标准菌株。6 仪器与设备 显微镜，目镜放大倍数 10 倍，物镜放大倍数 100 倍。恒温培养箱，能够恒温至 35，控温精度0.5。高压蒸汽灭菌器，能够加热至 121。紫外灯，366 nm。封口机。无菌样品瓶，100 mL。三角瓶，100 mL。定量盘，97 孔。血球计数器。试验中使用的玻璃器皿和采样器具应按无菌操作要求包扎，于 121 高压蒸汽灭菌 20min，烘干，备用。灭菌后的采样瓶，两周内未使用，应重新灭菌。7 样品采集 据 IMO MEPC.300(72)：2018 及 IMO BWM.2/Circ.42：2020 的要求采集水样，4 冷藏保存，于 24 h 内完成检测。采样时现场同时测定水样盐度并记录。盐度的测定按 GB/T 17378.4 中要求执行。8 样品检测 样品稀释 8.1.1 盐度小于 1 的水样无需稀释，直接接种。8.1.2 盐度大于等于 1 的水样，取 10 mL 待测水样加入到装有 90 mL 生理盐水（5.5）的三角瓶（6.7）中混匀稀释后待接种。接种 8.2.1 盐度小于 1 的水样，量取 100 mL 置于无菌样品瓶（6.6）中，加入 1 支 Colilert 培养基（5.2），振摇至完全溶解后，倒入定量盘（6.8），抚平背面去除孔内气泡，用封口机封口待培养。8.2.2 盐度大于等于 1 的水样，量取 100 mL 按 8.1.2 稀释的水样置于无菌样品瓶（6.6）中，加入 1支 Colilert-18 培养基（5.3），振摇至完全溶解后，倒入定量盘（6.8），抚平背面去除孔内气泡，用封口机封口待培养。培养 将经8.2处理的定量盘置于恒温培养箱（6.2）中在35 5 下培养。盐度小于1的水样培养24 h，盐度大于等于1的水样培养18 h。结果判读与计数 8.4.1 对完成培养的定量盘进行结果判读,可使用标准样品比色盘进行辅助判读。定量盘孔出现黄色，且在 366 nm 紫外灯照射下有荧光，则判断为大肠埃希氏菌阳性孔，分别记录定量盘中大阳性孔和小阳性孔数量，结果记录参见表 B.1。8.4.2 判读和计数时，实验人员宜戴手套于黑暗环境中进行。警示紫外灯灯光应避免直射眼睛和皮肤。T/PSC 1.32022 3 对照试验 8.5.1 空白试验 检测时应用水（5.1）同时做实验室空白试验。空白试验定量盘无黄色且366 nm紫外灯照射下无荧光产生，该次样品检测结果有效。空白试验定量盘366 nm紫外灯照射下有荧光，该次样品检测结果无效，应查明原因后按第8章重新检测。8.5.2 阴性及阳性对照 分别取适量阳性对照标准菌株（5.6）和阴性对照标准菌株（5.7）加入少许生理盐水（5.5）制成高浓度菌悬液，用血球计数器（6.9）在显微镜（6.1）下初步测定浓度，后再加入一定量生理盐水（5.5）稀释至菌株浓度为3003000 个/mL的菌悬液，按8.2和8.3要求进行接种和培养。按8.4要求进行对照样品定量盘结果判读。阳性对照样品检测结果为黄色有荧光，阴性对照样品检测无黄色无荧光，则该次样品检测结果有效。否则该次检测结果无效，应按第8章重新检测。9 结果计算与表示 结果与计算 从97孔定量盘结果检索表（附录A）中查得每100 mL水样中大肠埃希氏菌的MPN值，再根据样本不同的稀释度进行计算。每100 mL水样中大肠埃希氏菌的计算公式如下：=(1)式中：C每100 mL水样中大肠埃希氏菌浓度，MPN/100 mL；A查附录A得到的MPN值，MPN/100 mL；f接种样品的稀释度。结果表示 结果保留两位有效数字，大于等于100时以科学计数法表示，结果单位为MPN/100 mL。10 质量保证和控制 每批次样品均应进行空白试验。每批次实验至少取待测样品数量的10%进行平行双样分析,其检测所得数值全部经对数(以10为底)转换后数值的相对标准偏差应小于等于25%。不同批次培养基应用有证标准菌株/标准样品进行培养基质量检验，其测定值应在保证值范围内。11 废物处理 警示实验产生的废物应经121 高压蒸汽灭菌20min后，再作为一般废物处理。T/PSC 1.32022 4 附录A （资料性）97 孔定量盘结果检索表 酶底物法97孔定量盘结果检索表（MPN/100 mL）见表A.1表A.4：表A.1 97 孔定量盘结果检索表（MPN/100 mL）（小孔 0 12）大孔阳大孔阳性格数性格数 小孔阳性格数小孔阳性格数 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0 2419.6 T/PSC 1.32022 8 附录B （资料性）检测结果记录表 压载水大肠埃希氏菌检测结果记录见表B.1。表B.1 压载水大肠埃希氏菌检测结果记录 项目名称 船舶名称 采样日期 采样舱名称 采样地点 检测日期 盐度 样品编号 采样 时间 检测 时间 稀释 倍数 阳性孔格数 查表结果 大肠埃希氏菌（MPN/100 mL）平均值 大孔 小孔 检测：校对：审核：T/PSC 1.32022 9 参考文献 1 HJ 1001 2018 水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法 2 IMO 2004 International Convention for the Control and Management of Ships Ballast Water and Sediments 3 EPA EPA/600/R-10/146:2010 Environment Technology Verification Program Document Generic Protocol for the Verification of Ballast Water Treatment Technologies