SN_T 2617-2022 冬生疫霉病菌检疫鉴定方法.pdf

I C S 6 5.0 2 0.2 0C C S B 1 6中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T2 6 1 72 0 2 2 冬生疫霉病菌检疫鉴定方法D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f P h y t o p h t h o r a h i b e r n a l i s C a r n e 2 0 2 2-0 7-0 7发布2 0 2 3-0 2-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布学兔兔 标准下载学兔兔 标准下载前 言本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1 部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国南宁海关、中华人民共和国天津海关。本文件主要起草人:吴品珊、雷荣、焦彬彬、闫正跃、罗加凤、杨翠云。S N/T2 6 1 72 0 2 2学兔兔 标准下载学兔兔 标准下载冬生疫霉病菌检疫鉴定方法1 范围本文件描述了植物检疫中冬生疫霉病菌P h y t o p h t h o r a h i b e r n a l i s C a r n e的检疫鉴定方法。本文件适用于针对冬生疫霉寄主的植株和果实以及夹带土壤的检疫鉴定。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 病原菌基本信息学名:P h y t o p h t h o r a h i b e r n a l i s C a r n e分类地位:真核生物域(E u k a r y o t a D o m a i n),菌藻界(C h r o m i s t a),卵菌门(O o m y c o t a),霜霉纲(P e r o n o s p o r e a),霜霉目(P e r o n o s p o r a l e s),霜霉科(P e r o n o s p o r a c e a e),疫霉属(P h y t o p h t h o r a)。传播途径:主要通过感病寄主、土壤和水流传播扩散。短距离传播为孢子囊借助灌溉、溅射的水、风雨或蜗牛传播,贸易性调运寄主苗木、果实是病菌远距离传播的主要方式。寄主范围:主要为柑橘属植物,还可侵染杜鹃等植物。病菌的其他信息参见附录A。5 方法原理依据病害症状、分离菌的形态特征和分子生物学特性,用常规P C R或荧光P C R特异性引物扩增冬生疫霉病菌的I T S(i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r)基因,或用重组酶聚合酶扩增(R e c o m b i n a s e P o l y m e r a s e Am p l i f i c a t i o n,R P A)特异性引物扩增r a s-r e l a t e d Y p t l基因,对冬生疫霉病菌进行综合检疫鉴定。6 仪器和用具6.1 仪器生物显微镜、体视显微镜、纯水仪、光照培养箱、高压灭菌锅、超净工作台、制冰机、P C R仪、实时荧光P C R仪、恒温扩增仪、凝胶成像系统、电泳仪、电子天平(感量0.0 1 g)、冰箱。6.2 用具烧杯、三角瓶、量筒、试管、培养皿、酒精灯、镊子、剪刀、解剖刀、载玻片、盖玻片、塑料研杵、移液器、移液器吸头、离心管、液氮罐、封口膜p a r a f i l m、基于链霉亲和素和荧光素的核酸检测试纸条。1S N/T2 6 1 72 0 2 2学兔兔 标准下载7 试剂、材料和培养基7.1 试剂琼脂粉、V 8液、碳酸钙、葡萄糖、琼脂糖、次氯酸钠溶液、匹马霉素、氨苄青霉素钠盐、利福平钠盐、五氯硝基苯、T w e e n 2 0、氯化钙、T r i s-HC l(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)缓冲液、氧化镁、2 8 0 mm o l/L醋酸镁溶液、T w i s t Am p n f o酶干粉、P B S T(含0.1%T w e e n 2 0的磷酸缓冲液)、盐酸、乙二胺四乙酸四钠盐(N a2E D T A)、十二烷基硫酸钠、氢氧化钠、醋酸钠、氯化钾、5 0T A E(T r i s-醋酸盐-E D T A)、无菌双蒸水、C T A B(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液、T r i s饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、R N a s e A、液氮、苯酚、三氧甲烷、蛋白酶K、T a q D NA聚合酶、T a q M a n P C R M a s t e r M i x、P C R反应缓冲液、核酸染料、d NT P、D NA分子质量标准物。7.2 材料马铃薯、雪松松针、柑橘叶片、冬生疫霉病菌D NA。7.3 培养基P A R P-V 8选择性培养基、V 8培养基、马铃薯葡萄糖培养基具体配方参见附录B。8 检疫鉴定方法 8.1 症状检查 观察柑橘等寄主果实是否有变褐色,叶片和小枝是否枯萎;杜鹃属等寄主植物叶片、根茎是否有病斑;其他寄主上为根部腐烂或溃疡。症状图片见附录A。检查寄主是否携带土壤或介质,收集土壤或介质做诱集试验。8.2 分离培养和诱集8.2.1 分离培养将疑似症状的柑橘果实表皮、植物根茎叶等其他组织,用0.5%次氯酸钠消毒2 m i n5 m i n,无菌水冲洗3次,灭菌滤纸吸干水分,放于P A R P-V 8选择性培养基或马铃薯葡萄糖培养基上。1 6 2 0 黑暗培养4 d 6 d,如有真菌菌落出现,转到V 8培养基上,1 6 2 0 黑暗培养。8.2.2 土壤和介质诱集 称取2 5 g土壤或介质,碾碎去杂放入灭菌烧杯中,加入无菌水将材料润湿,封口后置于1 6 2 0 黑暗放置。3 d 5 d后在烧杯中加入灭菌水,使水层高4.0 c m。取雪松松针或柑橘叶片,无菌水清洗后漂放在水面或浸在水中,1 6 2 0 黑暗诱集。2 d 3 d后开始检查,取有失绿或变色的雪松松针或柑橘叶片,无菌水冲洗,灭菌滤纸吸干水分,放于P A R P-V 8选择性培养基或马铃薯葡萄糖培养基上,如有真菌菌落出现,转至V 8培养基上1 6 2 0 黑暗培养纯化。8.2.3 孢子囊培养切取纯化菌落边缘菌丝块置于灭菌培养皿中,加无菌水至菌块表面有游离水,1 6 2 0 黑暗培2S N/T2 6 1 72 0 2 2学兔兔 标准下载养诱发孢子囊,1 d 2 d后观察孢子囊生成。8.2.4 卵孢子培养 将分离菌转到V 8培养基上,在7 8 黑暗培养4周6周,观察是否有卵孢子形成。8.3 分子生物学鉴定 8.3.1 D N A提取收集分离出的疑似真菌,放入1.5 m L离心管中,浸在液氮里用塑料研杵碾碎,采用C T A B法或植物基因组提取试剂盒提取D NA。D NA提取方法按附录C执行。8.3.2 常规P C R检测 特异性引物P H I B 1和P H I B 2的序列分别为5 -T C G G G T C T GAG C T AG T AG T C T T-3、5 -C T T C-C A C AA C C AAT T C C AT T AT G C-3。反应体系(2 5 L):样品D NA 2 L,1 0P C R b u f f e r 2.5 L,2.5 mm o l/L M g C L2 2.5 L,2.5 mm o l/L d NT P s 2.5 L,1 0 m o l/L 引物各0.5 L,5 U/l T a q D NA p o l y m e r a s e 0.2 L,d d H2O 1 4.3 L。反应条件:9 4 2 m i n;9 4 3 0 s、6 4 3 0 s、7 2 6 0 s,3 0个循环;7 2 1 0 m i n,4 保存。以冬生疫霉病菌的D NA作为阳性对照,以无菌水作为空白对照,以健康寄主植物D NA作为阴性对照。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶(含荧光染料)、1T A E 缓冲液进行电泳分离,用凝胶成像系统分析。8.3.3 实时荧光P C R检测特异性引物P H-F的序列为5 -C GA C T T G C C A C C G G GA-3、P H-R的序列为5 -AA C G G T A C T-T C T C T T T G C T C GAA-3、荧光探针P H-P r的序列为5 -(F AM)T T C C A C AA C C AAT T C C AT(N F Q-MG B)-3。反应体系(2 5 L):样品D NA 1 L,2T a q M a n P C R M a s t e r M i x 1 2.5 L,1 0 m o l/L特异性引物各1 L,1 0 m o l/L 探针P H-P r 0.5 L,d d H2O 9.0 L。反应条件:9 4 1 0 m i n;9 4 1 5 s、5 6 6 0 s,4 0个循环。以冬生疫霉病菌的D NA作为阳性对照,以无菌水作为空白对照,以健康寄主植物D NA作为阴性对照。8.3.4 R P A试纸条法特异性正向引物P h R P A-F的序列为5 -T T C C A C C C T T C C A C C AGA C T G C T GAG GAG G-3、反向引物P h R P A-R的序列为5 -(B i o t i n)T G T T AG C T G C G T G T T C G T T G G T C A C C C C AGA-3、探针P h R-P A-P的 序 列 为5 -(F AM)C T T C T G T GAT T T AT C C AGAAAAT C C G T A C GAT-TH F-GAG C T G-GA C G G C AAGA(C 3 s p a c e)-3。反应体系(5 0 L):将2 9.5 L再水化缓冲液、1 1.2 L无菌水、2.1 L 1 0 m o l/L正向引物、2.1 L 1 0 m o l/L反向引物和0.6 L 1 0 m o l/L探针溶液混匀后,加入到T w i s t Am pn f o酶干粉中,充分溶解后,加入2 L样品D NA和2.5 L醋酸镁(2 8 0 mm o l/L),置于3 8,反应2 0 m i n。以冬生疫霉病菌的D NA作为阳性对照,以无菌水作为空白对照,以健康寄主植物D NA作为阴性3S N/T2 6 1 72 0 2 2学兔兔 标准下载对照。以上每个反应液,分别取1 0 L加入9 0 L P B S T,充分混合后,取1 0 L加于图1所示的样品区,并将其竖直放入装有2 0 0 L P B S T 的1.5 m L离心管中,观察检测线和控制线位置的显色情况。当控制线出现条带后,再放置2 m i n,取出试纸条,立即观察,并拍照保存。图1 试纸条9 鉴定标准 9.1 菌落特征在马铃薯葡萄糖培养基上生长缓慢,2 0 下生长速度为3.5 mm/d 4 mm/d。菌落白色,花瓣状,边缘不规则,菌丝紧贴培养基表面生长,气生菌丝较少。V 8培养基上菌落无色,边缘规则,菌丝紧贴培养基表面生长,气生菌丝极少,2 0 下生长速度为3 mm/d 3.5 mm/d。菌落图片见附录D。9.2 病菌形态孢子囊长卵圆形或椭圆形,易脱落,顶部具有不完全的乳头状突起,靠近半乳突处最宽,基部锥形;孢子囊大小(2 9 m5 3 m)(1 4 m2 2 m)平均(4 0 m1 9 m),长宽比较大,为1.8 1 2.4,孢子柄长2 3 m7 3 m;孢囊梗长2 3 m7 3 m,不分枝或形成不规则合轴式长侧枝;孢子囊低温萌发释放游动孢子;该菌无菌丝膨大体和厚垣孢子。该病菌为同宗配合,藏卵器大小为2 2 m5 6 m(平均3 5 m);雄器多围生,偶侧生,平均1 0 m1 5 m;卵孢子大小为2 2 m4 5.6 m(平均3 0 m),黄橙色,壁厚1 m3 m,且卵孢子充满藏卵器。