SN_T 5477-2022 布赫纳蝗螨检疫技术规范.pdf

I C S6 5.0 2 0.3 0C C SB4 1中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 4 7 72 0 2 2 布赫纳蝗螨检疫技术规范Q u a r a n t i n e p r o t o c o l f o r L o c u s t a c a r u s b u c h n e r i2 0 2 2-0 7-0 7发布2 0 2 3-0 2-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布学兔兔 标准下载学兔兔 标准下载前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、中华人民共和国太原海关、中华人民共和国潍坊海关、中华人民共和国长春海关。本文件主要起草人:张体银、黄嫦娇、巩红霞、郑腾、王武军、田国宁、宋战昀、常亚琦、张志灯、于师宇。S N/T5 4 7 72 0 2 2学兔兔 标准下载学兔兔 标准下载布赫纳蝗螨检疫技术规范1 范围本文件规定了布赫纳蝗螨的形态学、聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应检测方法。本文件适用于熊蜂中布赫纳蝗螨的检测和鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B 1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语下列缩略语适用于本文件:C t 循环阈值(C y c l e t h r e s h o l d)D NA脱氧核糖核酸(D e o x y r i b o n u c l e i c a c i d)d NT P三磷酸脱氧核苷酸(D e o x y n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e)E B溴化乙锭(E t h i d i u m b r o m i d e)I T S内转录间隔区(I n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e)P C R聚合酶链式反应(P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n)T B E三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸(T r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e-b o r i c a c i d-e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d)T E缓冲液T r i s-E D T A缓冲液(T r i s-E D T A b u f f e r)5 设备、材料和试剂5.1 设备5.1.1 解剖显微镜。5.1.2 高压灭菌锅。5.1.3 P C R仪。5.1.4 荧光P C R仪。5.1.5 高速冷冻离心机(转速1 2 0 0 0 r/m i n)。1S N/T5 4 7 72 0 2 2学兔兔 标准下载5.1.6 微量移液器。5.1.7 生物安全柜。5.1.8 D NA相对分子质量标准品(1 0 0 b p 1 0 0 0 b p)。5.1.9 水平电泳仪。5.1.1 0 凝胶成像系统。5.1.1 1 电子天平(感量0.0 1 g)。5.1.1 2 冰箱(2 8 和-2 0)。5.2 试剂5.2.1 水:符合G B/T 6 6 8 2一级水的规格。5.2.2 液氮。5.2.3 乳酸。5.2.4 无水乙醚。5.2.5 无水乙醇。5.2.6 0.0 1 m o l/L磷酸盐(P B S)缓冲液,配制方法见附录A.1。5.2.7 1 0%S D S溶液,配制方法见附录A.2。5.2.8 蛋白酶K。5.2.9 5 m o l/L的N a C l溶液,配制方法见附录A.3。5.2.1 0 C T A B/N a C l溶液,配制方法见附录A.4。5.2.1 1 三氯甲烷/异戊醇混合液,配制方法见附录A.5。5.2.1 2 酚/三氯甲烷/异戊醇混合液,配制方法见附录A.6。5.2.1 3 异丙醇。5.2.1 4 T E缓冲液。5.2.1 5 1 0P C R 缓冲液。5.2.1 6 d NT P s(含d C T P、d G T P、d AT P、d T T P)。5.2.1 7 T a q D NA聚合酶。5.2.1 8 琼脂糖。5.2.1 9 0.5T B E缓冲液(配制方法见附录A.7)。5.2.2 0 上样缓冲液(配制方法见附录A.8)。5.2.2 1 核酸凝胶染料。5.2.2 2 D NA相对分子质量标准物M a r k e r。5.2.2 3 D NA纯化回收试剂盒。5.3 P C R引物上游引物L o c-F 1:5 -AA C C AT T C T C T C AAT T C A C C T-3;下游引物L o c-R 1:5 -T C G AAG AAG GAT G T G T T G AAG T-3;根据布赫纳蝗螨线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因序列设计,扩增长度约为2 2 8 b p,用双蒸水溶解至1 0 m o l/L后,保存于-2 0 备用。5.4 实时荧光P C R引物和探针上游引物L o c-F 2:5 -G GA C C C AAT C C T AT T C C A G C A-3;下游引物L o c-R 2:5 -T G T T G T G GA GAT G T G T GA T A C G-3;T a q M a n探针q P C R-P:F AM-T GA T T C T T C G GA C A C C C A GAG G T C T-T AMR A;2S N/T5 4 7 72 0 2 2学兔兔 标准下载根据布赫纳蝗螨线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因序列设计,扩增长度约为1 0 3 b p,用双蒸水溶解至1 0 m o l/L后,保存于-2 0 备用。5.5 质控物质使用感染布赫纳蝗螨的熊蜂样品组织或含目的片段的D NA作为阳性对照;使用未感染布赫纳蝗螨的健康熊蜂样品组织作为阴性对照;用水作为空白对照。6 采样6.1 采样比例6.1.1 当蜂群数量1 0群时,所有蜂群均采样。6.1.2 当数量在1 1群1 0 0群时,以1 0群采样量为基础,每增加1 0群,采样量增加1群。6.1.3 当蜂群数量为1 0 1群2 0 0群时,按总群数的1 5%采样。6.1.4 当蜂群数量2 0 0群时,以2 0 0群采样量为基础,每增加2 0群,采样量增加1群。6.2 采样方法从每个选定蜂群中采取活力较弱的熊蜂3 0只,放入烧杯内盖好,记录群号。检验前先将活蜂用乙醚处死或置于冰箱冷冻室内冷冻1 0 m i n。7 形态学检测7.1 样品处理随机选取1 0只熊蜂,去除翅和足。将样品放入5 0 m L量杯中,加入2 0 m L水,1 0 0 0 0 r/m i n匀浆3次,每次3 0 s,制成悬液,经0.8 mm滤膜过滤,用水悬浮至2 0 m L,滤液经2 0 0 0 r/m i n离心5 m i n,弃去上清,在沉淀物中加入1 0 0 L乳酸,静置1 0 m i n,用解剖显微镜观察。7.2 镜检将处理好的样品进行解剖显微镜观察,根据布赫纳蝗螨若螨、成螨等各个时期的形态进行鉴别(基本信息及形态参见附录B和附录C)。7.3 结果判定根据镜检观察到的形态特征的符合程度可初步判定为阴性或疑似阳性,再进一步进行P C R或荧光P C R试验。8 P C R检测8.1 设立对照从提取D NA开始,每个步骤均需设立阳性对照、阴性对照、空白对照。实验室检测条件应符合G B 1 9 4 8 9实验室生物安全通用要求中二级生物安全防护要求。8.2 D N A的提取8.2.1 每群选取3只5只处死后的熊蜂或死后新鲜的熊蜂,用灭菌的剪刀剪取腹部组织,转入3S N/T5 4 7 72 0 2 2学兔兔 标准下载2.0 m L研磨管中,置于样品制备仪进行研磨处理,也可直接选取可疑虫体及其宿主熊蜂进行研磨处理。8.2.2 取研磨后的样本约2 5 m g转移至另一1.5 m L离心管中,加入5 0 L T E缓冲液,使样品充分悬浮后,加入6 0 L 1 0%S D S溶液和1 0 L 2 0 m g/m L的蛋白酶K,混匀后于3 7 下温育1 h。8.2.3 加入1 0 0 L 5 m o l/L的N a C l溶液,上下颠倒充分混匀,加入8 0 L C T A B/N a C l溶液,混匀后6 5 温育1 0 m i n;加入7 0 0 L氯仿/异戊醇(体积比为2 41),混匀后1 2 0 0 0 r/m i n离心5 m i n。8.2.4 吸取上清至另一干净离心管,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(三者体积比为2 52 41),上下颠倒混匀,1 2 0 0 0 r/m i n 离心5 m i n。8.2.5 吸取上清至另一干净离心管,加入2倍体积预冷的异丙醇沉淀D N A,轻轻混匀,4 下1 2 0 0 0 r/m i n离心1 5 m i n,彻底去除上清。8.2.6 用6 0 0 L 7 0%预冷的乙醇洗涤沉淀,4 下1 2 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n,弃上清,再瞬时离心,用移液器彻底吸除酒精,在超净工作台上自然晾干。8.2.7 加入2 0 L T E缓冲液溶解D NA,-2 0 下保存。8.2.8 D NA提取也可选用等效的商品化试剂盒。8.3 P C R扩增8.3.1 反应体系普通P C R反应体系见表1。P C R扩增可以采用等效的商品化D NA扩增试剂盒。表1 普通P C R反应体系名称工作浓度终浓度加样量1 0P C R缓冲液1 012.5 Ld N T P s1 0 mm o l/L0.2 mm o l/L0.5 LT a q D NA聚合酶5 U/L0.1 U/L0.5 L上游引物L o c-F 11 0 m o l/L0.4 m o l/L1.0 L下游引物L o c-R 11 0 m o l/L0.4 m o l/L1.0 L模板D NA2.0 L水1 7.5 L总体积2 5 L 注:反应体系中各试剂的量可根据反应体系总体积进行适当调整。8.3.2 反应程序9 4 预变性5 m i n;之后9 4 变性4 5 s,5 5 退火3 0 s,7 2 延伸4 5 s,共3 5个循环;7 2 补充延伸1 0 m i n,4 保温。8.4 琼脂糖凝胶电泳用T B E电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶,同时加入使用浓度的核酸凝胶染料。将凝胶放入水平电泳槽,使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6 L样品和2 L上样缓冲液按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用D NA相对分子质量标准品作对照。5 V/c m电泳约0.5 h,当指示剂到达底部时停止。4S N/T5 4 7 72 0 2 2学兔兔 标准下载8.5 凝胶成像分析和测序将电泳完毕的凝胶用凝胶成像仪观察并判断结果,经核酸扩增电泳后如出现一条大小约2 2 8 b p的D NA片段,应切胶回收D NA片段进行测序,也可直接送P C R产物进行测序。8.6 结果判定经P C R扩增并电泳后阳性对照会出现一条大小约2 2 8 b p的D NA片段,而阴性对照和空白对照无条带时,试验成立。待检样品经核酸扩增电泳后,出现大小约2 2 8 b p的D NA条带并经测序验证,测序结果同参考序列(参见附录D.1)同源性要达到9 8%以上方可判为布赫纳蝗螨核酸阳性;无条带或条带的大小不是约2 2 8 b p或条带的大小约2 2 8 b p,但测序结果同参考序列同源性低于9 8%的判为布赫纳蝗螨核酸阴性。9 实时荧光P C R9.1 设立对照同8.1。9.2 D N A提取同8.2。9.3