SN_T 5469-2022 铁皮石斛鉴定方法.pdf

I C S6 5.0 2 0.0 1C C SB 1 6中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 4 6 92 0 2 2 铁皮石斛鉴定方法D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f D e n d r o b i u m c a t e n a t u m L i n d l.2 0 2 2-0 7-0 7发布2 0 2 3-0 2-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布学兔兔 标准下载学兔兔 标准下载前 言本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国拱北海关技术中心、中华人民共和国上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、中华人民共和国杭州海关技术中心、中华人民共和国海口海关热带植物隔离检疫中心。本文件主要起草人:张卫东、李伟刚、水克娟、薛华杰、张明哲、潘英文、黄永辉、权永兵、徐淼锋、廖力、林伟、闫邦奇。S N/T5 4 6 92 0 2 2学兔兔 标准下载学兔兔 标准下载铁皮石斛鉴定方法1 范围本文件描述了铁皮石斛的形态学和D NA条形码检验鉴定方法。本文件适用于铁皮石斛及其产品的鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 G B/T 1 9 4 9 5.2 转基因产品检测 实验室技术要求3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1萼片 s e p a l 花的外轮花被片。注:包括1片中萼片(背萼片)和 2片侧萼片。3.2花瓣 p e t a l 内轮花被片中的左右两片。3.3蕊柱 c o l u m n 融合有雄性及雌性生殖器官的柱状结构。3.4唇瓣 l a b e l l u m 内轮花被片中央的1片变态而成,常有鲜艳的色泽和复杂的结构。4 铁皮石斛基本信息学名:D e n d r o b i u m c a t e n a t u m L i n d l.中文名:铁皮石斛 异名:D e n d r o b i u m o f f i c i n a l e K i m u r a&M i g o;D e n d r o b i u m t o s a e n s e M a k i n o;D e n d r o b i u m f u n i u s-h a n e n s e T.B.C h a o,Z.X.C h e n&Z.K.C h e n;D e n d r o b i u m p e r e f a u r i e i H a y a t a;D e n d r o b i u m s t r i c k-l a n d i a n u m R c h b.f.;C a l l i s t a s t r i c k l a n d i a n a(R c h b.f.)K u n t z e 俗名:黑节草、黄石斛分类地位:被子植物A n g i o s p e r m s,单子叶植物分支 M o n o c o t s,天门冬目A s p a r a g a l e s,兰科O r c h i-1S N/T5 4 6 92 0 2 2学兔兔 标准下载d a c e a e,石斛属D e n d r o b i u m。5 方法原理 根据石斛属的内转录间隔区(i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r 2,I T S 2)序列特征,应用D NA条形码技术对铁皮石斛进行鉴定,通过肉眼、放大镜和体视显微镜观察铁皮石斛的茎、叶和花等形态特征进行种类鉴定。6 主要仪器设备、用具和试剂6.1 主要仪器设备 P C R仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、体视显微镜、生物显微镜、分析天平(感量0.1 m g)、低温冷冻高速离心机、微量分光光度仪、组织研磨器、生物安全柜、冰箱。6.2 用具 移液器(1 0 0 0 L、2 0 0 L、1 0 0 L、1 0 L、2.5 L)及配套枪头、放大镜、离心管、研钵、镊子等。6.3 主要试剂 T r i s饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、7 5%乙醇、9 5%乙醇、十二烷基硫酸钠(S D S)、P V P 4 0、-巯基乙醇、蛋白酶K(2 0 mm o l/L)、R N a s e A、液氮、T E缓冲液、1 0P C R缓冲液、氯化镁(2 5 mm o l/L)、d NT P(1 0 mm o l/L)、Ta q酶(5 U/L)、引物、琼脂糖、D NA分子量标记和电泳缓冲液。除另有规定外,所有试剂均为分析纯,试验用水应符合G B/T 6 6 8 2中相关规定。7 鉴定方法7.1 形态学鉴定 通过肉眼、放大镜和体视显微镜观察铁皮石斛的茎、叶和花,依据其与近似种的形态特征(参见附录A、附录B)进行种类鉴定。7.2 分子生物学检测7.2.1 D N A提取 铁皮石斛D NA提取方法按附录C执行。7.2.2 P C R检测 铁皮石斛P C R检测应设置空白核酸提取对照和空白扩增对照,每个样品设置两个平行反应,具体方式按照G B/T 1 9 4 9 5.2中相关规定进行。具体操作按附录D执行,铁皮石斛及常见近似种I T S 2基因序列表信息参见附录E。8 形态学鉴定特征8.1 石斛属主要形态特征 附生草本。茎丛生,少有疏生在匍匐茎上的,直立或下垂,圆柱形或扁三棱形,不分枝或少数分枝,2S N/T5 4 6 92 0 2 2学兔兔 标准下载具少数或多数节,有时1至数个节间膨大成种种形状,肉质(亦称假鳞茎)或质地较硬,具少数至多数叶。叶互生,扁平,圆柱状或两侧压扁,先端不裂或2浅裂,基部有关节和通常具抱茎的鞘。总状花序或有时伞形花序,直立,斜出或下垂,生于茎的中部以上节上,具少数至多数花,少有退化为单朵花的;花小至大,通常开展;萼片近相似,离生;侧萼片宽阔的基部着生在蕊柱足上,与唇瓣基部共同形成萼囊;花瓣比萼片狭或宽;唇瓣着生于蕊柱足末端,3裂或不裂,基部收狭为短爪或无爪,有时具距;蕊柱粗短,顶端两侧各具1枚蕊柱齿,基部具蕊柱足;蕊喙很小;花粉团蜡质,卵形或长圆形,4个,离生,每2个为一对,几无附属物。8.2 铁皮石斛形态特征8.2.1 基本生物学特性 多年生草本。8.2.2 植株形态特征8.2.2.1 茎 铁皮石斛的茎直立,圆柱形,长约9 c m3 5 c m,粗2 mm4 mm,不分枝,具多节,节间长1.3 c m1.7 c m。8.2.2.2 叶 叶二列,互生于茎的中部以上,通常3枚5枚,纸质,长圆状披针形,长3 c m4 c m,宽9 mm1 1 mm,先端钝并且多少有钩转,基部下延为抱茎的鞘,边缘和中脉常带淡紫色。叶鞘常具紫斑,老时其上缘与茎松离而张开,并且与节留下1个环状铁青的间隙。8.2.2.3 花 总状花序从落了叶的老茎上部发出,通常2朵3朵花。花序柄长5 mm1 0 mm,基部具2枚3枚短鞘,花序轴回折状弯曲,长2 c m4 c m。花苞片干膜质,浅白色,卵形,长5 mm7 mm,先端稍钝。花梗和子房长2 c m2.5 c m。萼片和花瓣为黄绿色,长圆状披针形,长约1.8 c m,宽4 mm5 mm,先端锐尖,具5条脉,侧萼片基部较宽阔,宽约1 c m。唇瓣白色,基部具1个绿色或黄色的胼胝体,卵状披针形,比萼片稍短,中部反折,先端急尖,不裂或不明显3裂,中部以下两侧具紫红色条纹,边缘多少呈波状。唇盘密布细乳突状的毛,并且在中部以上具1个紫红色斑块。萼囊圆锥形,长约5 mm,末端圆形。蕊柱黄绿色,长约3 mm,先端两侧各具1个紫色斑点。蕊柱足黄绿色带紫红色条纹,疏生毛。药帽白色,长卵状三角形,长约2.3 mm,顶端近锐尖且2裂。8.3 铁皮石斛与近似种的主要区别 铁皮石斛与近似种的主要区别参见附录B。9 结果判定9.1 形态学结果判定 以茎、叶、花的形态特征为依据,符合8.2所描述的形态鉴定特征的,判定为铁皮石斛。9.2 分子生物学结果判定 送检样品I T S 2基因序列结果与铁皮石斛基因序列相似性最高,最大相似度在 9 9%以上,且形态3S N/T5 4 6 92 0 2 2学兔兔 标准下载学特征符合8.2描述的形态鉴定特征的,判定为铁皮石斛。送检样品I T S 2基因序列结果与铁皮石斛基因序列相似性低于9 9%,判定为非铁皮石斛。1 0 标本和样品的保存和处理1 0.1 标本和样品的保存 样品应在低温的条件下保存,保存期为1年,以备复验。1 0.2 结果记录与资料保存 完整的试验记录包括:样品的来源、种类、时间,试验的时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员和审核人员签字。检测需有最终的试验数据、电泳结果照片等。原始数据应归档,妥善保管,以备复验、谈判和仲裁。1 0.3 样品处理 保存期满后,样品经灭活后妥善处理。4S N/T5 4 6 92 0 2 2学兔兔 标准下载附 录 A(资料性)铁皮石斛及近似种形态特征图标引序号说明:1-3 细茎石斛D e n d r o b i u m m o n i l i f o r m e(L.)S w.:1.植株,2.唇瓣正面观,3.药帽正面观;46 霍山石斛D.h u o s h a n e n s e C.Z.T a n g e t S.J.C h e n g:4.植株,5.唇瓣正面观,6.药帽正面观;79 铁皮石斛D.c a t e n a t u m L i n d l.:7.植株,8.唇瓣正面观,9.药帽正面观。图A.1 铁皮石斛及近似种形态特征(引自中国植物志)5S N/T5 4 6 92 0 2 2学兔兔 标准下载附 录 B(资料性)铁皮石斛近缘种类群检索表1 萼片和花瓣淡黄色、奶黄色至金黄色,除唇瓣外决不带紫色或其他颜色2萼片和花瓣紫红色、天蓝色、白色或淡黄绿色,有时后来渐转变为淡黄色或乳黄色,先端常染有紫红色 1 52 茎上部常分枝,叶狭长圆形,宽不及7 mm,先端2圆裂细叶石斛D.h a n c o c k i i R o l f e茎不分枝,叶宽1 c m以上,先端锐尖、不裂33 花单生于叶腋,干后蜡质,唇瓣卵状菱形,无任何斑纹罗河石斛D.l o h o h e n s e T a n g&W a n g花通常2至多朵组成总状花序或伞形花序,极罕为单花,干后不为蜡质44 伞形花序几乎无花序柄,唇盘具2个紫红色斑块束花石斛D.c h r y s m n h u m W a l l.&L i n d l.总状花序,唇盘不具2个紫红色斑块55 茎上下一致的圆柱形,节和节间不肿胀6茎常在中部或中部以上的节间增粗,有时呈纺锤形或稍呈棒状1 16 花序出自已落了叶的茎上7花序出自带叶的茎中部或中部以上部分,花序柄与茎交成近垂直,花瓣全缘1 47 花序轴长不及5 c m,唇瓣边缘具啮蚀状细齿黄花石斛D.d i x a n t h u m R c h b.花序轴长1 0 c m以上,唇瓣边缘无啮蚀状细齿或不明显88 唇瓣近圆形,凹陷成兜状杓唇石斛D.m o s c h a t m n(B u c h.-H a m.)S w.唇瓣近圆形,不凹陷成兜状99 花序柄基部被覆着长5 mm2 0 mm套叠的大鞘,花苞片大,舟状,长1.8 c m3 c m线叶石斛D.a u r a n t i a c u m(F.M u e l l.)M u e l l.花序柄基部被覆着长3 mm1 0 mm套叠的小鞘,花苞片小,卵形,长约5 mm1 01 0 唇瓣圆形,具1个横生的半月形的深紫色斑块,边缘其复流苏流苏石斛D.f i m b r i a t u m H o o k.