SN_T 5558-2022 转基因香石竹（康乃馨）检测 普通PCR和实时荧光PCR法.pdf

I C S6 5.0 2 0.0 1C C SB1 6中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 5 5 82 0 2 2 转基因香石竹(康乃馨)检测普通P C R和实时荧光P C R法D e t e c t i o n o f g e n e t i c a l l y m o d i f i e d c a r n a t i o n(D i a n t h u s c a r y o p h y l l u s)c o n v e n t i o n a l P C R a n d r e a l-t i m e P C R m e t h o d s 2 0 2 2-0 7-0 7发布2 0 2 3-0 2-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布学兔兔 标准下载学兔兔 标准下载前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件部分方法参考了欧盟联合研究中心转基因食品及饲料欧洲联合参考实验室(E u r o p e a n U n i o n R e f e r e n c e L a b o r a t o r y f o r G e n e t i c a l l y M o d i f i e d F o o d a n d F e e d,t h e J o i n t R e s e a r c h C e n t r e o f t h e E u r o p e a n C o mm i s s i o n)和I S O 2 1 5 7 0:2 0 0 5已验证的方法。一致性程度为非等效。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、中国检验检疫科学研究院。本文件主要起草人:李想、尹璐、付伟、左翠花、印丽萍、郭德华、戚龙君、叶军。S N/T5 5 5 82 0 2 2学兔兔 标准下载学兔兔 标准下载转基因香石竹(康乃馨)检测普通P C R和实时荧光P C R法1 范围本文件规定了香石竹(康乃馨)中转基因成分的普通P C R和实时荧光P C R检测方法。本文件适用于香石竹(康乃馨)中转基因成分的定性筛选检测,也适用于转基因香石竹(康乃馨)M o o n b e r r yTM 2 5 9 5 8、M o o n v e l v e tTM 2 6 4 0 7、M o o n l i t eTM 1 2 3.2.3 8(4 0 6 4 4)和M o o n s h a d eTM 1 2 3.2.2(4 0 6 1 9)品系的品系特异性定性检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B/T 1 9 4 9 5.2 转基因产品检测 实验室技术要求G B/T 1 9 4 9 5.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法G B/T 1 9 4 9 5.7 转基因产品检测 抽样和制样方法G B/T 2 7 4 0 3 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语、定义和缩略语3.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1香石竹(康乃馨)D i a n t h u s c a r y o p h y l l u s石竹科石竹属多年生草本植物。香石竹在全世界范围广泛种植,是四大鲜切花之一,也可提取香精用做化妆品原料。3.1.2转基因 t r a n s g e n e将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能D NA序列,通过生物工程技术,使其在该物种中进行表达,以便使该物种获得新的品种特征。3.1.3实时荧光 P C R r e a l-t i m e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n实时荧光聚合酶链式反应。是指在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个P C R进程,荧光信号的强弱直接反映模板数量。3.1.4内源基因 e n d o g e n o u s g e n e在被检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因,一般为该物种特有基因。该基因可用1S N/T5 5 5 82 0 2 2学兔兔 标准下载于判定物种特异性。3.1.5外源基因 e x o g e n o u s g e n e利用生物工程技术转入的其他物种的基因。注:转入外源基因后,该生物品种表现新的生物学性状。3.1.6最低检出限 l i m i t o f d e t e c t i o n定性方法的最低检出限是指被检测物能被可靠检出的最低浓度或含量。3.2 缩略语下列缩略语适用于本文件。AN S:a n t h o c y a n i d i n s y n t h a s e g e n e,花青素合成酶基因;B HQ 1:B l a c k h o l e q u e n c h e r 1,黑洞猝灭基团1。b p:b a s e p a i r,碱基对。B P 4 0:F l a v o n o i d 3,5-h y d r o x y l a s e(F 35H)e n z y m e o f V i o l a w i t t r o c k i a n a,三色堇黄烷酮3,5-羟化酶基因。CH S:c h a l c o n e s y n t h a s e g e n e p r o m o t e r,查尔酮合成酶基因启动子。C t:C y c l e t h r e s h o l d,每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。C T A B:c e t y l t r i t h y l a mm o n i u m b r o m i d e,十六烷基三甲基溴化铵。D F R:d i h y d r o f l a v o n o l-4-r e d u c t a s e t e r m i n a t o r,二氢黄酮醇-4-还原酶基因终止子。D NA:d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d,脱氧核糖核酸。d AT P:d e o x y a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e,脱氧腺苷三磷酸。d C T P:d e o x y c y t i d i n e t r i p h o s p h a t e,脱氧胞苷三磷酸。d G T P:d e o x y g u a n o s i n e t r i p h o s p h a t e,脱氧鸟苷三磷酸。d NT P:d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e,脱氧核苷三磷酸。d T T P:D e o x y t h y m i n e t r i p h o s p h a t e,脱氧胸腺嘧啶三磷酸。E D T A:e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d,乙二胺四乙酸。F 3 5 H:F l a v o n o i d 3,5-h y d r o x y l a s e(F 35H)e n z y m e o f P e t u n i a h y b r i d a,矮牵牛黄烷酮3,5-羟化酶基因。F AM:C a r b o x y f l u o r e s c e i n,羧基荧光素。P C R:p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n,聚合酶链式反应。S UR B:h e r b i c i d e t o l e r a n t a c e t o l a c t a t e s y n t h a s e(A L S)e n z y m e,抗除草剂型乙酰乳酸合酶基因。S D S:s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e,十二烷基磺酸钠。p C a MV 3 5 S:3 5 S p r o m o t e r f r o m C a u l i f l o w e r m o s a i c v i r u s,来自于花椰菜花叶病毒的3 5 S启动子。T a q:T a q D NA p o l y m e r a s e,D NA聚合酶。T E:T r i s-HC l、E D T A缓冲液。T r i s:t r i s(h y d r o x y m e t h y l)a m i n o m e t h a n e,三(羟甲基)氨基甲烷。4 方法原理提取样品D NA后,采用普通P C R或实时荧光P C R技术对样品进行筛选基因检测,根据普通P C R电泳结果或实时荧光P C R扩增曲线的情况,判断样品中是否含有转基因成分。对筛选基因检测阳性的样品,或已知为转基因阳性的样品,如需进行品系鉴定,则采用标准中的品2S N/T5 5 5 82 0 2 2学兔兔 标准下载系特异性方法进行检测。根据普通P C R电泳结果或实时荧光P C R扩增曲线的情况,判断样品中含有哪些转基因香石竹品系。5 仪器设备与试剂5.1 仪器设备5.1.1 实时荧光P C R仪。5.1.2 普通P C R仪。5.1.3 样品粉碎仪或研磨机。5.1.4 天平:感量0.0 1 g。5.1.5 水浴锅或恒温孵育器。5.1.6 冷冻离心机。5.1.7 高压灭菌锅。5.1.8 涡旋振荡器。5.1.9 生物安全柜。5.1.1 0 p H计。5.1.1 1 紫外分光光度计。5.1.1 2 微量移液器(2.5 L、1 0 L、1 0 0 L、2 0 0 L、1 0 0 0 L)。5.2 主要试剂除特别说明外,所有试剂均为分析纯或生化试剂,实验用水应符合G B/T 6 6 8 2中一级水的规格。5.2.1 样品D N A提取纯化试剂5.2.1.1 1 m o l/L T r i sHC l,p H 8.0称取1 2 1.1 g T r i s,溶于8 0 0 m L水中,搅拌,加入浓盐酸4 2 m L,冷却至室温,用稀盐酸准确调整p H至8.0,分装后高压灭菌备用。5.2.1.2 0.5 m o l/L N a2-E D T A2 H2O,p H 8.0在8 0 0 m L H2O中加入1 8 6.1 g N a2-E D T A2 H2O,在磁力搅拌器剧烈搅拌,用N a OH调节p H值至8.0(约需2 0 g N a OH颗粒),然后定容至1 L,分装后高压灭菌备用。5.2.1.3 D NA抽提缓冲液量取1 0 0 m L 1 m o l/L T r i sH C l,5 0 m L 0.5 m o l/L N a2-E D T A2 H2O,称取5.0 g S D S,1 6.8 4 8 g N a C l,定容至1 L,分装后高压灭菌备用。5.2.1.4 T r i s 饱和酚5.2.1.5 氯仿5.2.1.6 异丙醇5.2.1.7 7 0%乙醇5.2.1.8 T E缓冲液量取1 0 m L 1 m o l/L T r i sHC l和2 m L 0.5 m o l/L N a2-E D T A2 H2O 加水定容至1 L,分装后高压灭菌备用。5.2.1.9 蛋白酶K(2 0 m g/m L)5.2.1.1 0 R N a s e A(1 0 0 m g/m L)3S N/T5 5 5 82 0 2 2学兔兔 标准下载5.2.2 普通P C R反应试剂5.2.2.1 1 0 P C R缓冲液:含5 0 0 mm o