T_HPCIA 005-2021 化妆品 美白功效的测定 斑马鱼胚法.pdf

ICS：71.100.70Y40团体标准团体标准T/HPCIA 005-2021化妆品 美白功效的测定 斑马鱼胚法Cosmetics-Determination of whitening-Zebrafish(Danio rerio)embryo assay2020 年 05 月 07 日发布2020 年 05 月 07 日实施广州开发区黄埔化妆品产业协会广州开发区黄埔化妆品产业协会发布全国团体标准信息平台目次前言.31.范围.42.术语和定义.43.规范性引用文件.4第一法 定性方法.44.方法原理.45.生物模型.46.材料与试剂.57.仪器与设备.58.实验过程.69.质量控制.610.废弃物处置.7第二法 定量方法.7(一)黑色素生成灰度检测法.711.方法原理.712.生物模型.713.材料与试剂.714.仪器与设备.815.实验过程.816.质量控制.917.废弃物处置.9(二)黑色素生成抑制检测法.918.方法原理.919.生物模型.920.材料与试剂.1021.仪器与设备.1022.实验过程.1123.质量控制.1224.废弃物处置.12(三)酪氨酸酶活性抑制检测法.1225.方法原理.1226.生物模型.1227.材料与试剂.1228.仪器与设备.1329.实验过程.1430.质量控制.1431.废弃物处置.15附录 A（资料性附录）胚胎正常发育参考图.16附录 B（资料性附录）产卵盒参考示意图.16附录 C（资料性附录）化妆品及原料前处理参考方法.18附录 D（资料性附录）数据记录表.19附录 E（资料性附录）斑马鱼养鱼及维护.20全国团体标准信息平台前言本标准是GB/T 1.1-2020给出规则起草。本标准由广州开发区黄埔化妆品产业协会提出。本标准由广州开发区黄埔化妆品产业协会归口。本标准起草单位：广东科玮生物技术股份有限公司、广州环亚化妆品科技有限公司、广东袋鼠妈妈生物科技有限公司、广州市科能化妆品科研有限公司、广东创美抗衰老研究有限公司、广州天玺生物科技有限公司、广州红之化妆品有限公司、广州市暨优生物科技有限公司、广州奥蓓斯化妆品有限公司、广州鲁比生物科技有限公司、广州度普化妆品科学研究院、广州市络捷生物科技有限公司、广东省保化检测中心有限公司、广东药科大学、广东省人民医院、暨南大学化妆品与美容科学研究院。本标准主要起草人：郑伟东、梅文杰、宁雪萍、陈亮、刘芳、孙永、邓慧、张利春、史学东、王杰、何斌、王芬、黄晓婷、刘宁芝、袁婵龄、邹俊、黄裕、赵海山、张逸波。全国团体标准信息平台化妆品 美白功效的测定 斑马鱼胚法1.范围本标准规定了评价化妆品美白功效的斑马鱼胚实验的方法原理及操作。本标准适用于化妆品（膏霜、乳液、凝胶、精华，等）及化妆品原料的美白功效评价。2.术语和定义2.1.hpf受精后小时数的英文缩写，即“hours post-fertilization”。2.2.灰度值 Gray level指黑白图像中点的颜色深度，范围一般从 0 到 255，白色为 255，黑色为 0。2.3.吸光度 Optical density,OD入射光强度与透射光强度比值的常用对数值。表示被检测物吸收的光学密度。特定波长下,同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成正比关系。2.4.黑色素生成抑制率（%）Inhibition rate of melanin production经样品刺激后，斑马鱼胚胎中因样品对黑色素的抑制而导致的黑色素前后变化的比率。2.5.酪氨酸酶活性抑制率（%）Inhibition rate of tyrosinase activity经样品刺激后，斑马鱼胚胎中因样品对酪氨酸酶活性的抑制而导致的酪氨酸酶活性前后变化的比率。3.规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。化妆品安全技术规范（2015 版）QB/T 1684-2015 化妆品检验规则DB32T 3979-2021 实验用 斑马鱼 饲育技术条件OECD 236 Fish Embryo Acute Toxicity(FET)Test第一法 定性方法4.方法原理使用 6 孔细胞培养板，在空白对照或溶剂对照控制的条件下，将 68 hpf 的斑马鱼胚胎置于不同浓度的样品中，在 280.5 的条件下培养至 72 hpf，根据黑色素在鱼胚体表的沉积分布，观察黑色素含量的变化。5.生物模型全国团体标准信息平台5.1 成鱼采用性成熟、健康无畸形、产卵量高、产卵质量好的野生型斑马鱼 zebra fish（Danio rerio）成鱼（418 个月）进行产卵。成鱼的体长 35 cm，雄鱼体型修长，体色为柠檬色，腹部扁平。雌鱼体型丰满，腹部膨大、银亮，体色为银灰色。5.2 鱼胚实验鱼胚为处于 68 hpf 时期发育正常的受精卵（参考附录 A）。胚胎孵育温度：280.5。6.材料与试剂6.1.材料6.1.1.斑马鱼交配盒。（参考附录 B）6.1.2.胚胎收集器：100 mm 培养皿，参考附录 B。6.1.3.细胞培养板：24 孔细胞培养板：每孔容积 3.5 ml；6 孔细胞培养板：每孔容积 15.0 ml。6.1.4.离心管：50 ml。6.1.5.塑料滴管：3 ml，长约 150 mm。6.1.6.载玻片6.2.试剂除非另有说明，分析时使用符合国家标准的分析纯试剂。试验用水使用蒸馏水或去离子水。6.2.1.二甲基亚砜。6.2.2.熊果苷标准品（纯度98%）。6.2.3.氯化钠（NaCl）。6.2.4.氯化钾(KCl)。6.2.5.氯化钙(CaCl22H2O)。6.2.6.硫酸镁(MgSO47H2O)。6.2.7.标准稀释水。6.3.样品溶液6.3.1.样品储备液：将已知量的样品溶于一定体积蒸馏水、去离子水或二甲基亚砜中。6.3.2.样品稀释液：用标准稀释水将样品储备液稀释成所需要的浓度。6.4.对照组溶液6.4.1.空白对照组：标准稀释水标准稀释水配置方法：精密称取 17.2 g 氯化钠，0.76 g 氯化钾，2.9 g 氯化钙，4.9 g 硫酸镁，用蒸馏水或去离子水溶解并定容至 1000 ml。取以上标准稀释水储备液 16.67 ml，再用蒸馏水或去离子水稀释至 1000 ml 即可。6.4.2.溶剂（阴性）对照组：二甲基亚砜溶液（1%），水溶性样品无溶剂对照组。6.4.3.阳性对照组：熊果苷标准储备溶液（0.5 mg/ml）。精密称取熊果苷标准品（纯度98%）5.0 mg，用标准稀释水溶解并定容至 10 ml，于 28 保存。7.仪器与设备全国团体标准信息平台7.1.斑马鱼养殖系统：包括制水、储水、供水、排水及水循坏系统。7.2.连续变倍体视显微镜（带拍照功能）：最小放大倍数为目镜 230，物镜 1。7.3.恒温培养箱：温度调至 280.5。7.4.冰箱：冷藏室 2 8；冰冻室-18。7.5.电子天平：精度 0.1 mg。7.6.pH 计：测量范围 014,最小分度为 0.01 pH 单位。7.7.移液枪：0.5 l10 l、10 l100 l、100 l1000 l、1000 l5000 l。7.8.温度计：0 50。7.9.实验室一般常规器材。8.实验过程8.1.胚胎准备斑马鱼配种时，产卵盒外缸预先加入 2/3 的养殖水，接着套入带有胚胎分离作用的内缸，插入挡板，隔开雌雄两鱼。于实验前一天晚上选取大于 4 个月的性成熟的待配种斑马鱼按照 1:1 或 1:2 的雌雄比置于带有挡板的产卵盒中过夜，避光。次日早晨打开光源，抽出产卵盒的挡板使之进行交配产卵。交配 1 h 后，检查各缸成鱼产卵情况，用漏网勺收集斑马鱼交配产生的胚胎,养殖水冲洗至 100 mm 培养皿中，平均每个培养皿胚胎数量不超过300 枚。清除培养皿中的异物后，放入恒温培养箱里孵育。8.2.样品前处理参考附录 C 化妆品及原料前处理方法。8.3.实验方法在体视显微镜下用塑料滴管随机挑选 68 hpf 发育正常的胚胎用于实验（此时的胚胎为原肠期，参见附录 A）。使用 6 孔细胞培养板为实验载体，每孔加入胚胎 20 枚。用塑料吸管吸干养殖水后，每孔加入 5.0 ml 配制好的不同浓度的受试样品稀释液于上述 6 孔细胞培养板中，盖上盖板随后置于 280.5 恒温孵化箱中静置。各浓度组设置 3 个平行组，同时设置空白对照组或溶液对照组。于体视显微镜下（物镜 23 倍）观察和记录胚胎 24 hpf、48 hpf 及 72 hpf 时的黑色素颗粒分布。8.4.判定标准以下条件说明待测物具有美白功效:与空白、溶剂(阴性)对照组相比,待测物处理的斑马鱼胚明显变白，黑色素颗粒分布减少。8.5.实验结果24 hpf、48 hpf 及 72 hpf 时在体式显微镜下观察,于 48 hpf 和 72 hpf 时拍照记录。其中，每组实验取 3 尾鱼胚用于拍照，拍照时固定拍照参数，将鱼胚平躺固定，聚焦鱼胚卵黄囊部位进行拍照，观察各组斑马鱼体表黑色素颗粒的分布面积和数量。9.质量控制受试物组和阳性对照试验结果符合下列要求，结果方为有效。否则，应查明原因后重新进行试验。a）受试物组培养 72 hpf 后，受试物组鱼胚存活率80%，孵化率90%；全国团体标准信息平台b）阳性对照培养 72 hpf 后，阳性对照组鱼胚存活率80%，孵化率90%。10.废弃物处置试验用斑马鱼胚于 28 冰水中灭活处理后按一般废弃物处置。第二法 定量方法(一)黑色素生成灰度检测法11.方法原理使用 6 孔细胞培养板，在空白对照或溶剂对照控制的条件下，将 68 hpf 的斑马鱼胚胎置于不同浓度的样品中，在 280.5 的条件下培养至 72 hpf。根据受试样品配置成溶液孵育鱼胚 72 hpf 后，于 Image J 软件处理图像，根据灰度值大小，计算黑色素生成量。12.生物模型12.1 成鱼采用性成熟、健康无畸形、产卵量高、产卵质量好的野生型斑马鱼 zebra fish（Danio rerio）成鱼（418 个月）进行产卵。成鱼的体长 35 cm，雄鱼体型修长，体色为柠檬色，腹部扁平。雌鱼体型丰满，腹部膨大、银亮，体色为银灰色。12.2 鱼胚实验鱼胚为处于 68 hpf 时期发育正常的受精卵（参考附录 A）。胚胎孵育温度：280.5。13.材料与试剂13.1.材料13.1.1.斑马鱼交配盒。（参考附录 B）13.1.2.胚胎收集器：100 mm 培养皿，参考附录 B。13.1.3.细胞培养板：24 孔细胞培养板：每孔容积 3.5 ml；6 孔细胞培养板：每孔容积 15.0 ml。13.1.4.离心管：50 ml。13.1.5.塑料滴管：3 ml，长约 150 mm。13.1.6.载玻片13.2.试剂除非另有说明，分析时使用符合国家标准的分析纯试剂。试验用水使用蒸馏水或去离子水。13.2.1.二甲基亚砜。13.2.2.熊果苷标准品（纯度98%）。13.2.3.氯化钠（NaCl）。13.2.4.氯化钾(KCl)。13.2.5.氯化钙(CaCl22H2O)。13.2.6.硫酸镁(MgSO47H2O)。13.2.7.标准稀释水。全国团体标准信息平台13.3.样品溶液13.3.1.样品储备液：将已知量的样品溶于一定体积蒸馏水、去离子水或二甲基亚砜中。13.3.2.样品稀释液：用标准稀释水将样品储备液稀释成所需要的浓度。13.4.对照组溶液13.4.1.空白对照组：标准稀释水标准稀释水配置方法：精密称取 17.2 g 氯化钠，0.76 g 氯化钾，2.9 g 氯化钙，4.9 g 硫酸镁，用蒸馏水或去离子水溶解并定容至 1000 ml。取以上标准稀释水储备液 16.67 ml，再用蒸馏水或去离子水稀释至 1000 ml 即可。13.4.2.溶剂（阴性）对照组：二甲基亚砜溶液（1%），水溶性样品无溶剂对照组。13.4.3.阳性对照组：熊果苷标准储备溶液（0.5 mg/ml）。精密称取熊果苷标准品（纯度98%）5.0 mg，用标准稀释水