【发明专利】具有促进组织修复的家蝇多肽及其制备方法与应用 CN111269292A.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010142284.3(22)申请日 2020.03.04(71)申请人 南京中医药大学地址 210023 江苏省南京市栖霞区仙林大道138号(72)发明人 刘睿段金廒(74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限公司 32200代理人 楼高潮(51)Int.Cl.C07K 7/08(2006.01)C07K 1/14(2006.01)C07K 1/18(2006.01)C07K 1/20(2006.01)A61K 38/10(2006.01)A61K 8/64(2006.01)A61Q 19/00(2006.01)A61P 17/00(2006.01) (54)发明名称具有促进组织修复的家蝇多肽及其制备方法与应用(57)摘要本发明公开了具有促进组织修复的家蝇多肽及其制备方法与应用， 该多肽的氨基酸序列为： Leu-Ala-Asp-Glu-Glu-Ser-Arg-Glu-Arg-Ala-Thr-Leu-Leu-Gly。 本发明采用现代生化技术手段， 对家蝇中促进组织修复的多肽进行跟踪筛选和评价， 通过乙醇提取、 萃取、 离子交换树脂和反相高效液相色谱法等纯化方法制备得到， 实验结果表明， 该多肽可促进人永生化表皮细胞的增殖与迁移， 毒副作用低， 能够用于制备美白、 祛皱、 祛色斑等药物或护肤品， 可明显改善皮肤美感， 具有很好的应用前景。权利要求书2页 说明书4页序列表1页 附图2页CN 111269292 A2020.06.12CN 111269292 A1.一种促进组织修复的家蝇多肽， 其特征在于， 该多肽具有下述的氨基酸序列：Leu-Ala-Asp-Glu-Glu-Ser-Arg-Glu-Arg-Ala-Thr-Leu-Leu-Gly。2.权利要求1所述的促进组织修复的家蝇多肽的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤：(1)家蝇提取物的制备： 取粉碎或未粉碎的家蝇全体， 加入乙醇提取， 浓缩得到家蝇提取物；(2)萃取： 将步骤(1)的家蝇提取物， 用甲醇溶液分散， 加入氯仿， 充分振摇， 静置后， 弃去氯仿层， 将甲醇溶液部分离心、 浓缩干燥， 得到家蝇提取物甲醇部位；(3)强氧离子交换树脂分离： 取步骤(2)得到的甲醇部位， 用甲酸铵溶液复溶， 反复上样强氧离子交换树脂分离小柱， 先用510mM用甲酸铵溶液冲洗后， 再用甲酸铵溶液洗脱小柱， 收集洗脱液， 得到家蝇多肽部位；(4)反相色谱分离纯化： 取步骤(3)得到的家蝇多肽部位， 以甲酸溶液复溶后， 经过反相制备高效液相色谱分离， 流动相： A相为体积浓度0.1甲酸； B相为甲醇， 梯度洗脱； 流速： 510mL/min； 柱温： 30， 检测波长为220nm， 分离收集得到家蝇多肽， 该多肽氨基酸序列为：Leu-Ala-Asp-Glu-Glu-Ser-Arg-Glu-Arg-Ala-Thr-Leu-Leu-Gly。3.根据权利要求2所述的促进组织修复的家蝇多肽的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤：(1)家蝇提取物的制备： 取粉碎或未粉碎的家蝇全体， 加入体积浓度70乙醇提取， 过滤， 得提取物， 浓缩；(2)萃取： 将步骤(1)的家蝇提取物， 用体积浓度70甲醇溶液分散， 加入1/10体积的氯仿， 充分振摇， 静置后， 弃去氯仿层， 将甲醇溶液部分离心， 浓缩干燥， 得到家蝇甲醇提取物部位；(3)强氧离子交换树脂分离： 步骤(2)家蝇甲醇提取物部位， 用10mM甲酸铵溶液复溶， 甲酸铵溶液含25乙腈， pH 2.73； 反复上样强氧离子交换树脂小柱， 以保证样品充分吸附，用含25乙腈， pH 2.73的10mM甲酸铵溶液冲洗强氧离子交换树脂小柱78次后， 用含25乙腈， pH5的0.4M甲酸铵溶液洗脱强氧离子交换树脂小柱， 收集洗脱液， 得到家蝇多肽部位；(4)反相色谱分离纯化： 取步骤(3)得到的家蝇多肽部位， 以体积浓度0.1甲酸溶液复溶后， 经过反相制备高效液相色谱分离， 流动相： A相为体积浓度0.1甲酸； B相为甲醇， 梯度洗脱； 流速： 10mL/min； 柱温： 30， 检测波长为220nm， 分离收集得到家蝇多肽， 该多肽氨基酸序列为： Leu-Ala-Asp-Glu-Glu-Ser-Arg-Glu-Arg-Ala-Thr-Leu-Leu-Gly。4.根据权利要求2或3所述的促进组织修复的家蝇多肽的制备方法， 其特征在于， 梯度洗脱方式为： 在015min， 流动相B浓度由2体积比梯度提高至体积比35， 流速10mL/min。5.权利要求1所述的促进组织修复的家蝇多肽在制备促进组织修复或改善皮肤美感作用的药物、 化妆品或日化用品中的应用。6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于： 所述的药物的形式为片剂、 胶囊剂、 注射剂、 颗粒剂、 凝胶软膏剂、 软膏剂、 搽剂、 贴剂。7.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于： 所述的化妆品或日化用品的形式为凝胶软权利要求书1/2 页2CN 111269292 A2膏剂、 软膏剂、 搽剂、 贴剂、 霜剂、 洗涤剂、 乳剂、 凝胶或爽肤水。权利要求书2/2 页3CN 111269292 A3具有促进组织修复的家蝇多肽及其制备方法与应用技术领域0001本发明涉及一种活性多肽， 具体涉及一种家蝇提取物中分离得到的具有促进组织修复作用的活性多肽及其制备方法， 属于生物医药技术领域。背景技术0002皮肤创伤愈合是指由于遭受外力作用， 皮肤组织出现离断或缺损后的愈复过程，包括各种组织的修复与再生， 如细胞增殖、 分化、 迁移等过程。 表皮及其它组织再生通常发生在创伤后的24小时内， 伤口边缘的基底细胞即开始增生， 并在凝块下面向伤口中心迁移，形成单层上皮， 覆盖于肉芽组织的表面。 因此， 促进组织细胞增殖、 迁移、 修复对于创伤愈合非常重要。0003多肽类药物在促进创面愈合方面具有独特的优势， 效应强， 安全性高。 如表皮生长因子、 碱性成纤维细胞生长因子等多肽具有明显的修复创伤的作用； 且现代研究发现， 动物来源的活性多肽也具有非常好的促进创伤修复的功效。0004本草纲目 有关于金蝇幼虫可用来 “治小儿诸疳积、 疳疮， 热病谵语， 毒痢作吐。 ”金蝇幼虫具有健脾消积， 清热除疳的功效。 申请人前期研究发现， 家蝇提取物具有较好的促进人永生化表皮细胞(HaCat)增殖与迁移的作用， 但是其功效成分仍不明确。发明内容0005发明目的： 本发明的目的在前期研究基础上， 通过大量实验筛选， 采用现代生化技术手段， 对家蝇提取物中促进组织修复成分进行跟踪评价， 通过萃取、 强氧离子交换色谱和反相高效液相色谱法等纯化方法制备得到一种促进组织修复的家蝇多肽， 实验结果表明，本发明分离得到的多肽具有很好的促进HaCat细胞增殖与迁移的作用， 有很好的促进组织修复的功效。0006技术方案： 为了实现以上目的， 本发明采取的技术方案为：0007一种促进组织修复的家蝇多肽， 该多肽具有下述的氨基酸序列： Leu-Ala-Asp-Glu-Glu-Ser-Arg-Glu-Arg-Ala-Thr-Leu-Leu-Gly。0008本发明所述的促进组织修复的家蝇多肽的制备方法， 包括以下步骤：0009(1)家蝇提取物的制备： 取粉碎或未粉碎的家蝇全体， 加入乙醇提取， 浓缩得到家蝇提取物；0010(2)萃取： 将步骤(1)的家蝇提取物， 用甲醇溶液分散， 加入氯仿， 充分振摇， 静置后， 弃去氯仿层， 将甲醇溶液部分离心、 浓缩干燥， 得到家蝇提取物甲醇部位；0011(3)强氧离子交换树脂分离： 取步骤(2)得到的甲醇部位， 用甲酸铵溶液复溶， 反复上样强氧离子交换树脂分离小柱， 先用510mM用甲酸铵溶液冲洗78次后， 再用甲酸铵溶液洗脱小柱， 收集洗脱液， 得到家蝇多肽部位；0012(4)反相色谱分离纯化： 取步骤(3)得到的家蝇多肽部位， 以甲酸溶液复溶后， 经过反相制备高效液相色谱分离， 流动相： A相为体积浓度0.1甲酸； B相为甲醇， 梯度洗脱； 流说明书1/4 页4CN 111269292 A4速： 510mL/min； 柱温： 30， 检测波长为220nm， 分离收集得到家蝇多肽， 该多肽氨基酸序列为： Leu-Ala-Asp-Glu-Glu-Ser-Arg-Glu-Arg-Ala-Thr-Leu-Leu-Gly。0013作为优选方案， 以上所述的促进组织修复的家蝇多肽的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤：0014(1)家蝇提取物的制备： 取粉碎或未粉碎的家蝇全体， 加入体积浓度70乙醇提取， 过滤， 得提取物， 浓缩；0015(2)萃取： 将步骤(1)的家蝇提取物， 用体积浓度70甲醇溶液分散， 加入1/10体积的氯仿， 充分振摇， 静置后， 弃去氯仿层， 将甲醇溶液部分离心， 浓缩干燥， 得到家蝇甲醇提取物部位；0016(3)强氧离子交换树脂分离： 步骤(2)家蝇甲醇提取物部位， 用10mM甲酸铵溶液复溶， 甲酸铵溶液含25乙腈， pH 2.73； 反复上样强氧离子交换树脂小柱， 以保证样品充分吸附， 用含25乙腈， pH 2.73的10mM甲酸铵溶液冲洗强氧离子交换树脂小柱78次后，用含25乙腈， pH5的0.4M甲酸铵溶液洗脱强氧离子交换树脂小柱， 收集洗脱液， 得到家蝇多肽部位；0017(4)反相色谱分离纯化： 取步骤(3)得到的家蝇多肽部位， 以体积浓度0.1甲酸溶液复溶后， 经过反相制备高效液相色谱分离， 流动相： A相为体积浓度0.1甲酸； B相为甲醇， 梯度洗脱； 流速： 10mL/min； 柱温： 30， 检测波长为220nm， 分离收集得到家蝇多肽， 该多肽氨基酸序列为： Leu-Ala-Asp-Glu-Glu-Ser-Arg-Glu-Arg-Ala-Thr-Leu-Leu-Gly。0018作为优选方案， 以上所述的促进组织修复的家蝇多肽的制备方法， 梯度洗脱方式为： 015min， 流动相B浓度由2体积比梯度提高至35体积比， 流速10mL/min。0019本发明所述的促进组织修复的家蝇多肽在制备促进组织修复或改善皮肤美感作用的药物、 化妆品或日化用品中的应用。 所述的药物的形式为片剂、 胶囊剂、 注射剂、 颗粒剂、 凝胶软膏剂、 软膏剂、 搽剂等。0020所述的化妆品或日化用品的形式为软膏剂、 搽剂、 贴剂(如面膜)、 霜剂(如面霜)、洗涤剂(如香皂、 沐浴液等)、 乳剂、 凝胶或爽肤水等。0021本发明对于现有技术具有如下的有点与效果：0022(1)本发明首次从家蝇中分离纯化鉴定了就有促进组织修复作用的多肽， 其氨基酸序列为： Leu-Ala-Asp-Glu-Glu-Ser-Arg-Glu-Arg-Ala-Thr-Leu-Leu-Gly。0023(2)本发明的多肽在较低浓度(5 M)下即可促进HaCat的增殖和迁移。0024(3)本发明的多肽稳定性好， 在胃肠道作用下未见水解， 可用于组织修复和消化道溃疡。0025(4)本发明的多肽具有能够美白、 祛皱、 祛色斑等作用， 可明显改善皮肤美感。附图说明0026图1为本发明提供的多肽的质谱图。0027图2为家蝇修复肽对HaCat细胞的增殖作用。0028图3为家蝇修复肽对HaCat细胞的促迁移折线图。说明书2/4 页5CN 111269292 A5具体实施方式0029下面结合具体实施例进一步阐明本发明， 应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围， 在阅读了本发明之后， 本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。0030实施例1家蝇修复肽的制备方法， 其包括以下步骤：0031(1)家蝇提取物的制备： 用70乙醇提取粉碎或未粉碎的家蝇全体， 提取物浓缩；0032(2)萃取： 将家蝇提取浓缩物用70甲醇溶液分散， 加入约1/10体积的氯仿， 充分振摇， 静置后， 弃去氯仿层，