【发明专利】冬凌草甲素在制备蛋白激酶B抑制剂方面的应用 CN107550900A.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710872587.9(22)申请日 2017.09.25(71)申请人 中美 （河南） 荷美尔肿瘤研究院地址 450000 河南省郑州市金水区东明路127号(72)发明人 董子钢李美贤宋孟秋刘雪娇刘康栋(74)专利代理机构 郑州联科专利事务所(普通合伙) 41104代理人 时立新杨海霞(51)Int.Cl.A61K 31/352(2006.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称冬凌草甲素在制备蛋白激酶B抑制剂方面的应用(57)摘要本发明属于医药领域， 具体涉及冬凌草甲素在制备蛋白激酶B特异性抑制剂方面的应用。 冬凌草甲素 （Oridonin） ， 分子式： C20H28O6， 分子量：364.44。 本发明经试验发现： 冬凌草甲素通过对蛋白激酶B （AKT） 的抑制作用而抑制肿瘤的生长。本发明验证了冬凌草甲素能够抑制蛋白激酶B激酶活性、 抑制食管鳞癌细胞KYSE70， KYSE450的增殖、 以及抑制食管癌人源化移植瘤模型 （PDX） 肿瘤的生长， 从而显示了冬凌草甲素对肿瘤有显著的抑制效果。 冬凌草甲素作为蛋白激酶B抑制剂能够用于多种肿瘤 （食管癌、 肺癌、 胃癌、 结肠癌、肝癌、 乳腺癌等） 的预防及治疗。权利要求书1页 说明书4页 附图3页CN 107550900 A2018.01.09CN 107550900 A1.冬凌草甲素在制备蛋白激酶B抑制剂方面的应用。2.如权利要求1所述的应用， 其特征在于， 冬凌草甲素通过抑制蛋白激酶B激酶活性来预防和抑制肿瘤生长， 冬凌草甲素对蛋白激酶B产生抑制作用的浓度范围为510 M。3.如权利要求2所述的应用， 其特征在于， 冬凌草甲素在制备抗肿瘤药物方面的应用。4.如权利要求3所述的应用， 其特征在于， 冬凌草甲素在制备预防和抑制食管鳞癌药物方面的应用。5.如权利要求4所述的应用， 其特征在于， 冬凌草甲素在浓度范围为:2.520 M时能够抑制食管鳞癌细胞的增殖。6.如权利要求3所述的应用， 其特征在于， 冬凌草甲素在制备抑制食管癌人源化移植瘤模型肿瘤生长药物中的应用。7.如权利要求6所述的应用， 其特征在于， 冬凌草甲素在剂量40 mg/kg、 160 mg/kg时能抑制食管癌人源化移植瘤模型肿瘤的生长。权利要求书1/1 页2CN 107550900 A2冬凌草甲素在制备蛋白激酶B抑制剂方面的应用技术领域0001本发明属于医药领域， 具体涉及冬凌草甲素在制备蛋白激酶B抑制剂方面的应用，其通过抑制蛋白激酶B激酶活性来预防和抑制肿瘤的生长， 尤其是蛋白激酶B在食管鳞癌发生发展中的功能研究。背景技术0002冬凌草甲素 （Oridonin） 是从唇形科植物冬凌草Rabdosia rubescens （Hemsl. ） Hara中分离的四环二萜类有效成分， 主要用于抗菌、 杀虫清热解毒、 消炎止痛、 健胃活血及等作用。 AKT也被称为蛋白激酶B （PKB） ， 其涉及多条信号通路， 通过影响下游多种因子的活化状态， 发挥着抑制凋亡、 促进增殖的关键作用。 蛋白激酶B激酶本身及其上游调节分子在超过50%的人类肿瘤中均有异常改变。 抑制蛋白激酶B对于预防和治疗肿瘤具有重要作用。本发明经研究发现： 蛋白激酶B在食管鳞癌中高度表达且具有重要作用， 冬凌草甲素对肿瘤的抑制作用机制与其抑制蛋白激酶B激酶活性相关， 这一发现将对具有蛋白激酶B异常表达的肿瘤病人的治疗具有重要意义。发明内容0003本发明目的在于提供一种天然化合物冬凌草甲素在制备蛋白激酶B抑制剂方面的应用， 并阐明蛋白激酶B （AKT） 在食管鳞癌发生发展中的重要作用。0004为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案：冬凌草甲素 （Oridonin） ， 别名： 冬凌草素， 分子式： C20H28O6， 分子量： 364.44， 是一种淡黄色针状结晶， 可溶于甲醇、 乙醇、 DMSO等有机溶剂。0005本发明提供了冬凌草甲素在制备蛋白激酶B抑制剂方面的应用。 即本发明发现了冬凌草甲素对蛋白激酶B激酶的抑制作用， 因而冬凌草甲素可用作制备蛋白激酶B抑制剂。0006本发明发现： 冬凌草甲素通过抑制蛋白激酶B激酶活性来预防和抑制肿瘤生长， 冬凌草甲素对蛋白激酶B产生抑制作用的浓度范围为510 M。0007进一步的， 本发明还提供了冬凌草甲素在制备抗肿瘤药物方面的应用。 如， 本发明提供了冬凌草甲素在制备预防和抑制食管鳞癌药物方面的应用。 本发明经实验发现： 蛋白激酶B （AKT） 在食管鳞癌组织中高表达， 冬凌草甲素通过抑制蛋白激酶B激酶活性来预防和抑制肿瘤生长。 因此， 冬凌草甲素可用于制备预防和抑制食管鳞癌药物。 冬凌草甲素在浓度范围为2.520 M时能够抑制食管鳞癌细胞 （KYSE70， KYSE450） 的增殖。0008本发明还提供了冬凌草甲素在制备抑制食管癌人源化移植瘤模型肿瘤生长药物中的应用， 即其可以抑制食管癌人源化移植瘤模型 （PDX） 肿瘤的生长。0009进一步的， 冬凌草甲素对PDX模型肿瘤的抑制作用与其抑制蛋白激酶B激酶活性有关， 冬凌草甲素在剂量40 mg/kg、 160 mg/kg时能抑制食管癌人源化移植瘤模型肿瘤的生长。 PDX模型荷瘤小鼠在用冬凌草甲素治疗后， 肿瘤样本p-AKT、 p-GSK3 的表达量显著性降低。说明书1/4 页3CN 107550900 A30010和现有技术相比， 本发明的有益效果：1） 本发明经试验发现： 冬凌草甲素对肿瘤的抑制作用机制与其抑制蛋白激酶B激酶活性相关， 这一发现将对具有蛋白激酶B异常表达的肿瘤病人的治疗具有重要意义；2） 本发明经试验发现： 蛋白激酶B在食管鳞癌组织中高表达， 且其在癌旁组织中的表达也显著高于正常组织， 说明蛋白激酶B在食管鳞癌的发生发展中具有重要作用；3） 以本发明为例， 可以将冬凌草甲素作为蛋白激酶B抑制剂应用于肿瘤的预防及治疗中。 蛋白激酶B与细胞存活、 细胞凋亡密切相关， 抑制蛋白激酶B激酶的活性能够起到预防及治疗肿瘤的作用。 本发明中冬凌草甲素能够抑制蛋白激酶B激酶活性， 并能够抑制食管癌细胞增殖、 抑制食管癌人源化移植瘤模型 （PDX） 肿瘤的生长。 因此冬凌草甲素可应用于多种肿瘤 （食管癌、 肺癌、 胃癌、 结肠癌、 肝癌、 乳腺癌等） 的预防及治疗， 可能也会通过对蛋白激酶B激酶活性的抑制而抑制肿瘤的生长。 此外， 本发明的冬凌草甲素还可与其他化疗药或激酶抑制剂一起使用， 用于肿瘤的预防及治疗。附图说明0011图1为蛋白激酶B （总蛋白和磷酸化蛋白） 在食管鳞癌组织芯片上的免疫组化染色结果。 蛋白激酶B在癌组织中的表达水平显著高于正常组织及癌旁组织；图2为冬凌草甲素对蛋白激酶B的抑制作用， 其中， 冬凌草甲素对蛋白激酶B产生抑制作用的浓度范围为:510 M；图3为冬凌草甲素在对食管鳞癌细胞的抑制作用， 其中， 冬凌草甲素在浓度范围为:2.520 M时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE70， KYSE450的增殖。 本图将对照组做为100%， 其他加药不同浓度组均与其进行比较计算出细胞活性。 *p0.05, *p0.01, *p0.001；图4为冬凌草甲素对食管癌人源化移植瘤模型 （PDX） EG9的预防及抑制作用结果。 冬凌草甲素在剂量为40 mg/kg及160 mg/kg时能显著抑制肿瘤的生长。 *p0.05, *p0.01；图5为PDX模型EG9肿瘤样本的免疫组化结果。 通过对冬凌草甲素用于PDX模型EG9肿瘤的预防及治疗作用中得到的肿瘤样本进行免疫组化染色， 发现肿瘤样本p-AKT, p-GSK3 的表达量显著性降低。 *p0.05, *p0.01, *p0.001；图6为冬凌草甲素对食管癌人源化移植瘤模型 （PDX） HEG18的预防及抑制作用结果。 冬凌草甲素在剂量为40 mg/kg及160 mg/kg时能显著抑制肿瘤的生长。 *p0.05, *p0.01；图7为PDX模型HEG18肿瘤样本的免疫组化结果。 通过对冬凌草甲素用于PDX模型HEG18肿瘤的预防及治疗作用中得到的肿瘤样本进行免疫组化染色， 发现肿瘤样本p-AKT, p-GSK3 的表达量显著性降低。 *p0.05, *p0.01, *p0.001。具体实施方式0012以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍， 但本发明的保护范围并不局限于此。0013实施例：材料与方法。00141、 材料。00151.1试剂说明书2/4 页4CN 107550900 A4冬凌草甲素购自西安普莱特生物工程有限公司， 纯度为98%。 蛋白激酶B激酶试剂盒购自CST公司。 MK2206购自selleckchem公司。 噻唑蓝 （MTT） 购自Ruitaibio公司。00161.2仪器与器材：1.2.1海尔医用低温保存箱 （青岛海尔特种电器有限公司）1.2.2电子天平 （梅特勒-托利多仪器上海有限公司）1.2.3 Thermo 超净工作台1.2.4酶标仪Multiskan GO microplate Spectrophotometer。00171.3 肿瘤组织本发明使用了两例人食管癌组织标本。 两种模型编号分别为EG9和HEG18。 EG9来源于河南省郑州大学第一附属医院， 男性， 66岁。 术后病理切片提示为： 鳞癌b级， 高中分化， 淋巴结有转移， 病理分期： T2N1M0。 HEG18来源于河南省肿瘤医院， 女性， 73岁。 术后病理切片提示为： 食管髓质型低分化鳞癌， 淋巴结有转移。 本发明使用的EG9模型为第8代， HEG18为第5代。00181.4 实验动物本实施例中SCID免疫缺陷小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。 许可证编号为： SCXK(京)2012-0001， SPF级， 6-8周龄， 体重16-18g， 雌鼠。 小鼠饲料购于北京华阜生物科技股份有限公司。 实验动物饲养于中美 （河南） 荷美尔肿瘤研究院的动物设施内， 在恒温（22-26） 、 恒湿 （45%-50%） 、 新鲜空气、 除尘除菌的无特殊病原菌 （SPF级） 饲养室条件下饲养， 动物先放于有机塑料盒内 （苏州市冯氏实验动物设备有限公司） ， 再置于IVC系统饲养，每个饲养盒内饲养3-4只动物， 经无菌处理的饲料供动物自由摄入， 高温消毒的垫料每三天更换一次， 笼具及饮水每三天紫外线消毒一次， 饮用无菌蒸馏水。 更换饲养用品时严格遵循无菌原则操作。 将实验动物在12:12小时光照/黑暗循环下饲养， 可以自由接近食物和水。00191.5 动物实验药物的配制药物溶剂为5%二甲基亚砜 （DMSO） ， 40%聚乙二醇400 （PEG400） ， 55%磷酸缓冲盐溶液（PBS） 。00202方法。00212.1 免疫组织化学实验收集临床食管鳞癌病人癌、 癌旁及正常组织， 经不同浓度酒精脱水处理后石蜡包埋制作组织芯片。 采用免疫组化试剂盒， 按照说明书给定的步骤进行实验， 经DAB显色并经苏木精复染后， 封片。 显微镜下拍照并统计分析不同组织中蛋白激酶B （总蛋白和磷酸化蛋白） 的阳性表达率。 结果见图1。00222.2 蛋白激酶B激酶实验根据CST公司激酶试剂盒提供的实验方案， 测定不同浓度冬凌草甲素、 及阳性对照药蛋白激酶B 激酶抑制剂MK2206对蛋白激酶B激酶的抑制作用。 结果见图2。00232.3 细胞增殖实验食管鳞癌细胞KYSE70， KYSE450接种于96孔板， 每孔1000-2000细胞， 24小时后分别加入不同浓度的冬凌草甲素， 分别在加药后0小时、 24小时、 48小时、 72小时加入20 l噻唑蓝， 随即放入37培养箱中孵育1个小时， 取出后将96孔板内的液体弃掉， 加入100 l二甲基亚砜（DMSO） ， 利用酶标仪在波长为570 nm和620 nm下检测细胞增殖情况， 测定吸光度OD值。 结果见图3。说明书3/4 页5CN 10