【发明专利】丁酸及其盐在制备治疗宫颈癌的药物中的应用 CN114796175A.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210666477.8(22)申请日 2022.06.13(71)申请人 杭州市五云山医院 （杭州市健康促进研究院）地址 310015 浙江省杭州市西湖区九溪五云东路6号(72)发明人 郭君萍王方岩张珂季夏薇(74)专利代理机构 北京盛询知识产权代理有限公司 11901专利代理师 蔺巍(51)Int.Cl.A61K 31/19(2006.01)A61P 35/00(2006.01)A61P 35/04(2006.01) (54)发明名称丁酸及其盐在制备治疗宫颈癌的药物中的应用(57)摘要本发明公开了丁酸及其盐在制备治疗宫颈癌的药物中的应用， 涉及生物医药技术领域。 本发明要求保护丁酸或丁酸盐在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。 本发明还要求保护丁酸或丁酸盐在制备诱导线粒体凋亡的制剂中的应用。 本发明通过CCK8实验、 EdU荧光实验、 Transwell实验、划痕实验、 蛋白印迹分析、 细胞流式分析、 ROS免疫荧光、 TUNEL实验、 CytC荧光实验和ROS流式分析表明， 丁酸及其盐通过激活线粒体依赖的凋亡途径抑制宫颈癌细胞系的增殖、 侵袭和迁移。权利要求书1页 说明书6页 附图4页CN 114796175 A2022.07.29CN 114796175 A1.丁酸或丁酸盐在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述丁酸或丁酸盐通过激活线粒体依赖的凋亡途径抑制宫颈癌细胞系的增殖、 侵袭和迁移。3.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述丁酸盐包括丁酸钠。4.丁酸或丁酸盐在制备诱导线粒体凋亡的制剂中的应用。5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述线粒体为内源性线粒体。6.一种用于诱导线粒体凋亡或治疗宫颈癌的药物， 其特征在于， 以丁酸或丁酸盐为主要成分。权利要求书1/1 页2CN 114796175 A2丁酸及其盐在制备治疗宫颈癌的药物中的应用技术领域0001本发明涉及生物医药技术领域， 特别是涉及丁酸及其盐在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。背景技术0002宫颈癌(cervical cancer， CC)是全球女性第四大常见癌症， 每年新增57万例， 死亡相关31.1万例， 严重威胁女性患者的生命和健康。 由于宫颈癌早期症状不明显， 大多数患者在诊断时处于中晚期， 5年生存率较低。 目前宫颈癌的治疗主要以手术为主， 辅以化疗和其他治疗， 例如放疗， 免疫和靶向治疗， 这些都可能会给患者的身体带来永久性的损害。 宫颈癌患者的治疗效果有限是由于人们对其发病机制的了解不完全。0003研究宫颈癌细胞系的凋亡途径， 开发抑制宫颈癌细胞系的增殖、 侵袭和迁移的药物， 对于治疗宫颈癌具有重要的现实意义。发明内容0004本发明的目的是提供丁酸及其盐在制备治疗宫颈癌的药物中的应用， 以解决上述现有技术存在的问题， 丁酸可以通过激活线粒体依赖的凋亡途径来抑制宫颈癌细胞系的增殖、 侵袭和迁移。0005为实现上述目的， 本发明提供了如下方案：0006本发明提供丁酸或丁酸盐在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。0007进一步地， 所述丁酸或丁酸盐通过激活线粒体依赖的凋亡途径抑制宫颈癌细胞系的增殖、 侵袭和迁移。0008进一步地， 所述丁酸盐包括丁酸钠。0009本发明还提供丁酸或丁酸盐在制备诱导线粒体凋亡的制剂中的应用。0010进一步地， 所述线粒体为内源性线粒体。0011本发明还提供一种用于诱导线粒体凋亡或治疗宫颈癌的药物， 以丁酸或丁酸盐为主要成分。0012本发明公开了以下技术效果：0013本发明通过CCK8实验、 EdU荧光实验、 Transwell实验、 划痕实验、 蛋白印迹分析、 细胞流式分析、 ROS免疫荧光、 TUNEL实验、 CytC荧光实验和ROS流式分析表明， 丁酸及其盐通过激活线粒体依赖的凋亡途径抑制宫颈癌细胞系的增殖、 侵袭和迁移。附图说明0014为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案， 下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得其他的附图。说明书1/6 页3CN 114796175 A30015图1为丁酸钠抑制人宫颈癌细胞的增殖， 用细胞计数试剂盒测定5mM丁酸钠作用12、 24、 48和72小时后Hela(A)和Caski(B)细胞的增殖情况； EdU荧光染色检测Hela(C)和Caski(E)细胞系中的凋亡细胞； D为C中红色荧光强度的定量分析； F为E中红色荧光强度的定量分析； G和I为流式细胞术分析Hela细胞的细胞周期分布， CON： 对照组； NaB： 5mM丁酸钠治疗48小时组； H为S期Hela细胞的定量分析； 所有上述数据均表示为平均值标准差； *P0.05， *P0.001；0016图2为丁酸钠减少宫颈癌细胞的侵袭和迁移， 划痕实验用于测定Hela(A)和Caski(C)细胞经5mM丁酸钠处理12、 24、 48小时后的迁移情况； B为Hela组伤口愈合率的定量分析；D为Caski组伤口愈合率的定量分析； E为采用Transwell法检测丁酸钠对Hela细胞侵袭和迁移的影响； F为采用Transwell法检测丁酸钠对Caski细胞侵袭和迁移的影响； CON： 对照组，NaB： 5mM丁酸钠治疗48小时组； 数据表示为平均值标准差； *P0.01， *P0.001；0017图3为丁酸钠促进宫颈癌细胞凋亡， 采用TUNEL(A)和AnnexinV/PI(B为CON组， C为NaB组)染色对Hela细胞凋亡进行定性和定量分析； D为蛋白印迹分析检测凋亡相关蛋白的表达； E为CON和NaB组蛋白表达的定量分析； CON： 对照组， NaB： 5mM丁酸钠治疗48小时组； 数据表示为平均值标准差； NS表示无显著性差异， *P0.001；0018图4为丁酸钠激活了宫颈癌线粒体依赖性凋亡途径； A为蛋白印迹分析定量检测Caspase 8、 9和12； B为Caspase 8、 9和12蛋白质表达的定量分析； D为蛋白印迹分析定量检测Apaf1、 BCL2和BAX； E为Apaf1、 BCL2和BAX蛋白质表达的定量分析； C为免疫荧光检测细胞色素C表达； F为免疫荧光检测活性氧的表达； GJ为流式细胞术定量检测048h的活性氧含量， 其中GJ依次为0h、 12h、 24h和48h； CON： 对照组， NaB： 5mM丁酸钠治疗48小时组； 数据表示为平均值标准差； NS表示无显著性差异， *P0.01。具体实施方式0019现详细说明本发明的多种示例性实施方式， 该详细说明不应认为是对本发明的限制， 而应理解为是对本发明的某些方面、 特性和实施方案的更详细的描述。0020应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式， 并非用于限制本发明。 另外， 对于本发明中的数值范围， 应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。 在任何陈述值或陈述范围内的中间值， 以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。 这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。0021除非另有说明， 否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。 虽然本发明仅描述了优选的方法和材料， 但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。 本说明书中提到的所有文献通过引用并入， 用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。 在与任何并入的文献冲突时， 以本说明书的内容为准。0022在不背离本发明的范围或精神的情况下， 可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。 本发明说明书和实施例仅是示例性的。0023关于本文中所使用的 “包含” 、“包括” 、“具有” 、“含有” 等等， 均为开放性的用语， 即说明书2/6 页4CN 114796175 A4意指包含但不限于。0024实施例10025一、 材料与方法00261.1试剂和抗体0027丁酸钠(纯度98)购自于aladdin， 将丁酸钠溶于培养基中配制成100mM原液，并用0.22 m过滤膜过滤， 保存在20。 半胱天冬酶3(Caspase 3， AC0301)和甘油醛3磷酸脱氢酶(glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase， GAPDH， ABPR001)的一抗分别购买于杭州Goodhere和上海Beyotime， CleavedCaspase 3(9661S)、 Caspase 9(#9508)和BCL2相关X(BCL2associated X， BAX， 2772)的一抗均购买于Cell Signaling Technology， Caspase 8(ET161270)、 Caspase 12(HA500144)、 B细胞淋巴瘤2(Bcell lymphoma 2， BCL2， ER170647)、 和细胞色素C(Cytochrome C， CytC， R151041)、 凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease activating factor 1,Apaf1， R131220)的一抗均购买于杭州HUABIO， 所有一抗以1:1000比例稀释。 二抗购买于武汉proteintech公司， 以1：5000比例稀释。 所有抗体均保存于4。00281.2细胞培养0029本实验所用宫颈癌细胞Hela、 Caski购买于美国American Type Culture Collection(ATCC)公司， Hela细胞使用含有10胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)的DMEM培养液培养， Caski细胞使用含有10FBS的1640培养液培养， 两种细胞均于37、 5CO2环境下培养。00301.3CCK8实验0031细胞计数盒(CK04， 日本同仁化学研究所)检测宫颈癌细胞的增殖能力。 将宫颈癌细胞Hela和Caski接种在96孔板中， 每孔计数3000个细胞并培养24h使其贴壁生长， 用含有5mM丁酸钠的正常培养液孵育12、 24、 48和72h， 使用纯培养基配制10CCK8工作液， 每孔加入100 L工作液， 两小时后吸取上清测量450nm处吸光度。 绘制吸光度时间的生长曲线。00321.4EdU荧光实验0033EdU荧光染色试剂盒(C103101试剂盒， 锐博生物)检测宫颈癌细胞的DNA复制活性。 Hela细胞和Caski细胞分别接种到含有细胞爬片的12孔板中， 培养24h， 加入5mM丁酸钠的正常培养液培养48h， 正常对照组不做处理。 后续进行EdU标记、 细胞固定化、 Apollo染色、DNA染色， 在荧光显微镜下观察各组的红色荧光强度。00341.5Transwell实验0035使用磷酸盐缓冲盐(phosphate buffer saline， PBS)将基质胶(CORNING)1： 20稀释， 各取200ul均匀铺在细胞小室中， 迁移组不做处理， 放入培养箱内2h， 析出多余的PBS。 使用胰蛋白酶消化Hela细胞和Caski细胞， 用无血清培养基重悬， 将细胞悬液接种到细胞小室， 下室中加入含有10FBS的培养基， 在细胞培养箱中培养， 其中Hela细胞培养8h， Caski细胞培养17h， 在室温下使用4多聚甲醛固定30min， 0.1结晶紫染色15min， 显微镜下拍摄视野。00361.6划痕实验0037将Hela细胞和Caski细胞接种于6孔板中， 待细胞长满后， 在每个孔的固定位置使用1ml枪头垂直划2道划痕， 空白对照组和药物处理组分别换为2FBS培养基和5mM的2