【发明专利】多发性骨髓瘤诊治标志物及其应用 CN106011288A.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610601404.5(22)申请日 2016.07.27(71)申请人 北京泱深生物信息技术有限公司地址 100080 北京市海淀区善缘街1号立方庭大厦3103室(72)发明人 杨承刚李曙光(51)Int.Cl.C12Q 1/68(2006.01)G01N 33/68(2006.01)G01N 33/574(2006.01)A61K 45/00(2006.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称多发性骨髓瘤诊治标志物及其应用(57)摘要本发明属于医药技术领域， 公开了一种ERI3基因及其编码的新用途。 本发明的研究证明，ERI3基因及其编码蛋白不仅可以作为诊断多发性骨髓瘤的分子标志物， 而且可以作为治疗多发性骨髓瘤的分子靶标。 本发明的上述研究成果为临床上提供了一种新的诊断方法和治疗手段。权利要求书1页 说明书12页序列表2页 附图1页CN 106011288 A2016.10.12CN 106011288 A1.检测ERI3基因或ERI3蛋白的产品在制备诊断多发性骨髓瘤或预测多发性骨髓瘤预后的工具中的应用。2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述检测ERI3基因或ERI3蛋白的产品包括检测ERI3基因或ERI3蛋白的表达水平的产品。3.根据权利要求1或2所述的应用， 其特征在于， 所述产品包括能够结合ERI3基因的核酸或者能够结合ERI3蛋白的物质； 所述核酸能够检测ERI3基因的表达水平； 所述物质能够检测ERI3蛋白的表达水平。4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增ERI3基因的引物如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。5.一种诊断多发性骨髓瘤或预测多发性骨髓瘤预后的工具， 其特征在于， 所述工具包括能够检测ERI3基因或ERI3蛋白的表达水平的工具。6.根据权利要求5所述的工具， 其特征在于， 所述工具包括能够结合ERI3基因的核酸或者能够结合ERI3蛋白的物质； 所述核酸能够检测ERI3基因的表达水平； 所述物质能够检测ERI3蛋白的表达水平。7.根据权利要求6所述的工具， 其特征在于， 所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增ERI3基因的引物如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。8.一种治疗多发性骨髓瘤的药物， 其特征在于， 所述药物包含ERI3基因或ERI3蛋白的抑制剂。9.根据权利要求8所述的药物， 其特征在于， 所述抑制剂能够抑制ERI3或涉及ERI3上游或下游途径的物质的表达或活性。10.权利要求8或9所述的抑制剂在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。权利要求书1/1 页2CN 106011288 A2多发性骨髓瘤诊治标志物及其应用技术领域0001本发明涉及肿瘤诊断、 治疗、 预测预后领域， 更具体地， 本发明涉及以检测ERI3异常为手段的肿瘤诊断、 预测预后方法； 及抑制ERI3基因或蛋白质的肿瘤治疗剂。背景技术0002多发性骨髓瘤(Multiplemyeloma,MM)是以恶性浆细胞聚集骨髓并在血液或尿液中出现单克隆蛋白(M蛋白)为特征的一种恶性疾病。 临床特点包括易发感染、 肾功能受损、贫血、 高钙血症及溶骨性病变。 MM约占所有恶性血液病的10， 好发于老年人， 随着我国人口老龄化， MM发病人数有增加的趋势。 目前认为MM发生是一个逐步进展的过程： 很多患者在早期发生意义不明的单克隆球蛋白症(MGUS)， 然后进展为MM， 部分患者最终发展为髓外骨髓瘤(浆细胞白血病)， 整个过程中患者骨髓浆细胞伴有多种基因的突变。 临床上， 根据MM的一些临床参数如M蛋白、 2-MG对MM进行分期， 以采取不同的治疗措施。 常用分期标准有Durie-Salmon(DS)分期系统及国际分期系统(ISS)。 ISS分期简便易行， 根据 2-MG和血清白蛋白两个指标将MM分为I期、 II期、 III期， III期患者病情与预后最差。 当前临床治疗各期MM的主要手段有激素、 烷基类药物、 免疫调节剂、 蛋白酶抑制剂等， 这些方法可使MM有所缓解，但最终难免复发， 因此有待开发一些新的诊断与治疗策略。发明内容0003本发明的目的之一在于提供一种通过检测ERI3基因或蛋白表达差异来诊断多发性骨髓瘤的方法。0004本发明的目的之二在于提供一种通过检测ERI3基因或蛋白表达差异来预测多发性骨髓瘤预后的方法。0005本发明的目的之三在于提供一种通过抑制ERI3基因或ERI3蛋白来治疗多发性骨髓瘤的方法。0006本发明的目的之四在于提供一种用于筛选治疗多发性骨髓瘤的药物的方法。0007本发明的目的之五在于提供一种用于治疗多发性骨髓瘤的药物。0008为了实现上述目的， 本发明采用了如下技术方案：0009本发明提供了检测ERI3基因或ERI3蛋白的产品在制备多发性骨髓瘤诊断工具中的用途。0010本发明还提供了检测ERI3基因或ERI3蛋白的产品在制备预测多发性骨髓瘤预后工具中的用途。0011进一步， 所述检测ERI3基因或ERI3蛋白的产品包括检测ERI3基因或ERI3蛋白的表达水平的产品。 所述产品包括能够结合ERI3基因的核酸或者能够结合ERI3蛋白的物质(例如抗体)。 所述核酸能够检测ERI3基因的表达水平； 所述物质能够检测ERI3蛋白的表达水平。0012本发明的检测ERI3基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能： 如说明书1/12 页3CN 106011288 A3PCR、 如Southern杂交、 Northern杂交、 点杂交、 荧光原位杂交(FISH)、 DNA微阵列、 ASO法、 高通量测序平台等。 使用该产品可以定性地、 定量地、 或半定量地实施分析。0013包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得， 或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因， 然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。0014进一步， 所述PCR方法为已知方法， 例如， ARMS(AmplificationRefractoryMutationSystem， 扩增不应突变系统)法、 RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、 嵌套PCR法等等。 扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、 表面等离子共振法(SPR法)、 PCR-RFLP法、 原位RT-PCR法、 PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、 PCR-SSP法、 AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、 和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。0015上面所述的核酸包括扩增ERI3基因的引物， 产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备， 通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计， 并通过化学合成来制备。0016在本发明的具体实施方案中， 所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物， 所述引物的序列如SEQIDNO.1(正向序列)和SEQIDNO.2(反向序列)所示。0017上面所述的核酸还可包括探针， 所述探针可以通过化学合成来制备， 通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计， 并通过化学合成来制备， 或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因， 并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。0018本发明的检测ERI3蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能： 例如，可以包括ELISA、 放射免疫测定法、 免疫组织化学法、 Western印迹等。0019本发明的检测ERI3蛋白的产品包括特异性结合ERI3蛋白的抗体或其片段。 可以使用任何结构、 尺寸、 免疫球蛋白类别、 起源等的抗体或其片段， 只要它结合靶蛋白质即可。 本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。 抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。 抗体片段可以包括F(ab )2、 Fab 、 Fab、 单链Fv(scFv)、 二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、 二聚化V区(双抗体)、 或含有CDR的肽。 本发明的检测ERI3蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸， 包含该核酸的载体， 和携带该载体的细胞。0020抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。 例如， 制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。 使用抗原免疫动物后， 从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。 然后从杂交瘤培养物收集抗体。 最后可以通过使用被用作抗原的ERI3蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对ERI3蛋白的单克隆抗体。 可以如下制备多克隆抗体： 用与上文相同的抗原免疫动物， 从经过免疫的动物收集血液样品， 从血液中分离出血清， 然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。 可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。0021标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。 例如， 可以如下荧光标记蛋白质或肽： 用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽， 添加用DMSO、 缓冲剂、 等准备的染料， 然后混合溶液， 再于室温放置10分钟。 另外， 标记可使用商品化的标记试剂盒， 诸如 生 物 素 标 记 试 剂 盒 ， 如 生 物 素 标 记 试 剂 盒 - N H 2 、 生 物 素 标 记 试 剂 盒 - S H说明书2/12 页4CN 106011288 A4(DojindoLaboratories)； 碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、 碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)； 过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、 过氧化物酶标记试剂盒-NH2(DojindoLaboratories)； 藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、 藻胆蛋白标记试剂盒-SH、 B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、 R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、 R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)； 荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、 HiLyteFluor(TM)555标记试剂盒-NH2、 HiLyteFluor(TM)647标记试剂盒-NH2(DojindoLaboratories)； 及DyLight547和DyLight647(TechnoChemicalCorp.)、 Zenon(TM)、 AlexaFluor(TM)抗体标记试剂盒、 Qdot(TM)抗体标记试剂盒(InvitrogenCorporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(FunakoshiCorporation)。 为了正确标记， 可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。0022作为依照本发明的检测产品的样品， 可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。 样品不受特别限制， 只要它适于本发明的测定； 例如， 它可以包括组织、 血液、 血浆、血清、 淋巴液、 尿液、 浆膜腔液、 脊髓液、 滑液、 房水、 泪液、 唾液、 或其级分或经过处理的材料。0023在本发明的具体实施方案中， 所述样品来自受试者的组织。0024在本发明中，“预后” 是指肿瘤患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过程或结果。 在本说明书中， 预后可以是通过手术处理抑制或缓解肿瘤生长后1、 2、 3、 4、 5、 6、7、 8、 9、 10、 15、 20年或更久时的生机状态。 预后可以通过检查生物标志物即ERI3蛋白或编码ERI3蛋白的基因来预测。 预后预测可以这样进行： 根据生物标志物的有或无， 或者升高或降低， 确定患者的预后是良好还是不良， 或者确定良好预后或不良预后的概率。0025在本发明中，“预后良好” 是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解肿瘤生长之后， 患者长