【发明专利】裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法 CN110455964A.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910971194.2(22)申请日 2019.10.14(71)申请人 江西中医药大学地址 330004 江西省南昌市湾里区兴湾大道818号(72)发明人 严志宏邓敏芝蔡瑛袁恩周立分顿珠次仁刘苗苗(74)专利代理机构 南宁新途专利代理事务所(普通合伙) 45119代理人 但玉梅(51)Int.Cl.G01N 30/02(2006.01)G01N 30/06(2006.01)G01N 30/72(2006.01)G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法(57)摘要本发明提供裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法， 属于化学成分分析技术领域。 步骤为S1： 采用乙醇加热超声提取的方法提取裂叶独活药材中的有效成分， 制得裂叶独活供试品溶液； 称取香豆素类标准品， 配制成标准品溶液； S2： 将供试品溶液和标准品溶液采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱方法进行检测； S3： 采用PeakView1.2软件对质谱的数据进行分析， 通过数据库快速筛查和二级质谱分析，从裂叶独活醇提取液快速鉴定多种香豆素类成分。 本发明从裂叶独活中共分离和鉴定出32个香豆素类化合物， 实现了裂叶独活香豆素较为全面和系统的分析， 为香豆素类成分定性分析和裂叶独活药理研究提供基础。权利要求书2页 说明书10页 附图3页CN 110455964 A2019.11.15CN 110455964 A1.裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法， 其特征在于， 包括以下步骤：S1： 采用乙醇加热超声提取的方法提取裂叶独活药材中的有效成分， 制得裂叶独活供试品溶液； 称取香豆素类标准品， 配制成标准品溶液；S2： 将供试品溶液和标准品溶液采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱方法进行检测；S3： 采用PeakView1.2软件对质谱的数据进行分析， 通过数据库快速筛查和二级质谱分析， 从裂叶独活醇提取液快速鉴定多种香豆素类成分。2.根据权利要求1所述的裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法， 其特征在于， 所述步骤S1中的具体做法为：S1.1供试品贮备液的制备： 将裂叶独活药材粉碎过80-120目筛， 精密称取5g， 按照固液比为1:10-12用体积浓度为70%的乙醇溶液浸泡20min-60min， 然后加热至45-50， 利用超声提取1-2h， 随后过滤取滤液； 将滤渣重复上述操作， 合并2次滤液， 浓缩至无醇味， 得浸膏；将浸膏用体积浓度为50%甲醇溶液定容至25mL， 得供试品贮备液， 4贮存备用；S1.2标准品贮备液的制备： 精密称取补骨脂素、 东莨菪内酯、 佛手柑内酯、 欧前胡素、 蛇床子素、 氧化前胡素、 二氢欧山芹醇当归酸酯七种标准品各1mg， 分别加入5mL体积浓度为50%的甲醇溶解， 制得质量浓度为200 g/mL标准品贮备液， 4贮存备用；S1.3供试品溶液和标准品溶液的准备： 取上述供试品贮备液和标准品贮备液各1mL， 分别转移至2mL离心管内， 放入低温高速离心机以13000rmin-1离心8-15min， 离心后分别取0.5mL上清液于1.5mL的进样瓶内， 即得裂叶独活供试品溶液和标准品溶液。3.根据权利要求1所述的裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法， 其特征在于， 所述步骤S2中， 采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱方法分别对裂叶独活供试品溶液和标准品溶液进行检测， 测定条件如下：色谱条件： 色谱柱规格为2.1100mm， 1.7 m； 柱温40， 进样量4 L， 流速0.25mL/min；以0.1%甲酸水溶液为流动相A， 以乙腈为流动相B进行梯度洗脱， 洗脱的程序为： 010min，5%15%B； 1020min， 15%25%B； 2030min， 25%45%B； 3032min， 45%47%B； 3235min， 47%B； 3540min， 47%50%B； 4045min， 50%55%B； 4550min， 55%95%B ； 5052min， 95%B； 5252.1min， 95%5%B； 52.155min， 5%B；质谱条件： 采用ESI电喷雾离子源， 正离子模式检测； 质量扫描范围m/z1001000， 喷雾电压5.5kV， 离子源温度500， 去簇电压100 eV， 碰撞能量45eV， 碰撞能量叠加15eV， 气帘气压力40psi， 雾化气和辅助气压力均为50psi， 数据采集时间55min， 采用 TOF-MS-IDA-MS/MS 方式采集数据， IDA设置响应值超过100cps的6个最高峰进行二级质谱扫描， 子离子扫描范围m/z： 501000， 满足该条件的优先进行二级扫描， 开启动态背景扣除；获得化合物的总离子流图、 一级质谱信息和二级质谱信息。4.根据权利要求1所述的裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法， 其特征在于， 所述步骤S3中， 通过数据库快速筛查和二级质谱分析， 从裂叶独活醇提取液快速鉴定多种香豆素类成分的具体方法为： 采用PeakView1.2软件对质谱的数据进行分析； 根据国内外专业数据库Pubmed， ChemSpider， Metlin， 中科院化学专业数据库及国内外裂叶独活及香豆素相关研究文献， 收集香豆素类化合物名称、 分子式及二级碎片信息， 初步建立裂叶独活香豆素类化学成分数据库， 结合软件XIC Manager的功能， 初步筛选出质量偏差小于5权利要求书1/2 页2CN 110455964 A210-6的香豆素成分， 然后将筛选出的成分进一步与对照品和文献中二级碎片比较， 从裂叶独活醇提物中共鉴定和推测出多种香豆素类化合物。权利要求书2/2 页3CN 110455964 A3裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法技术领域0001本发明涉及化学成分分析技术领域， 具体涉及裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法。背景技术0002香豆素是广泛分布于植物界中的次生代谢物质,常与生源密切的桂皮酸、 黄酮类、木脂素等伴生,广泛分布于高等植物中,尤其是伞形科、 芸香科、 菊科、 豆科、 兰科、 茄科、 瑞香科、 虎耳草科和木樨科等植物及微生物代谢产物中。 香豆素具有调节植物生长、 抗菌抗病毒、 抗凝血、 松弛平滑肌、 吸收紫外线和抗辐射等多种生物活性。 至今已从芸香科柑桔属植物中分离出多种香豆素类化合物。 伞形科独活属植物裂叶独活Heracleum millefolium Diels， 藏药名为巴木保， 又有别名千叶独活、 藏当归， 主要分布于我国西藏、 青海、 甘肃、 四川、 云南， 是一种常用藏药。 裂叶独活性味辛、 苦， 微温， 用于治疗风寒湿痹、 腰膝疼痛、 少阴伏风头痛、 腰膝疼痛， 头痛齿痛等症。 其中， 裂叶独活中主要的活性成分为香豆素， 因此， 建立一种高效快速的提取、 分离纯化和鉴定裂叶独活中香豆素的方法对于深化裂叶独活的药理作用研究及完善质量控制体系均具有重要的意义。0003目前国内外对独活的研究比较多， 对裂叶独活的研究相对较少。 饶高雄等通过柱层析和红外分光光度法从裂叶独活乙醇提取物中分离鉴定出11个化合物， 仅鉴定出6种香豆素类化学成分， 目前尚缺乏对裂叶独活中香豆素类化学成分的系统研究和药理作用研究。 超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用( UHPLC-Q-TOF/MS) 技术具有高分辨、 高灵敏的定性分析能力和强大的结构表征能力， 已广泛运用到中药化学成分分析快速分离和鉴定中。 但目前对裂叶独活醇提液中香豆素类成分的分析和鉴定方法里， 还没有应用该技术的相关报道， 如何设定色谱和质谱的条件， 同时高效分离多种香豆素类成分， 并对其进行鉴定， 是目前亟待解决的问题。发明内容0004本发明的发明目的在于： 针对上述存在的问题， 提供一种裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法， 从裂叶独活中共分离和鉴定出32个香豆素类化合物， 实现了裂叶独活香豆素较为全面和系统的分析， 为香豆素类成分定性分析和裂叶独活药理研究提供基础。0005为了实现上述目的， 本发明采用的技术方案如下：裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法， 包括以下步骤：S1： 采用乙醇加热超声提取的方法提取裂叶独活药材中的有效成分， 制得裂叶独活供试品溶液； 称取香豆素类标准品， 配制成标准品溶液；S2： 将供试品溶液和标准品溶液采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱方法进行检测；S3： 采用PeakView1.2软件对质谱的数据进行分析， 通过数据库快速筛查和二级质谱分说明书1/10 页4CN 110455964 A4析， 从裂叶独活醇提取液快速鉴定多种香豆素类成分。0006本发明中， 优选地， 所述步骤S1中的具体做法为：S1.1供试品贮备液的制备： 将裂叶独活药材粉碎过80-120目筛， 精密称取5g， 按照固液比为1:10-12用体积浓度为70%的乙醇溶液浸泡20min-60min， 然后加热至45-50， 利用超声提取1-2h， 随后过滤取滤液； 将滤渣重复上述操作， 合并2次滤液， 浓缩至无醇味， 得浸膏；将浸膏用体积浓度为50%甲醇溶液定容至25mL， 得供试品贮备液， 4贮存备用； S1.2标准品贮备液的制备： 精密称取补骨脂素、 东莨菪内酯、 佛手柑内酯、 欧前胡素、 蛇床子素、 氧化前胡素、 二氢欧山芹醇当归酸酯七种标准品各1mg， 分别加入5mL体积浓度为50%的甲醇溶解，制得质量浓度为200 g/mL标准品贮备液， 4贮存备用；S1.3供试品溶液和标准品溶液的准备： 取上述供试品贮备液和标准品贮备液各1mL， 分别转移至2mL离心管内， 放入低温高速离心机以13000rmin-1离心8-15min， 离心后分别取0.5mL上清液于1.5mL的进样瓶内， 即得裂叶独活供试品溶液和标准品溶液。0007本发明中， 优选地， 所述步骤S2中， 采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱方法分别对裂叶独活供试品溶液和标准品溶液进行检测， 测定条件如下：色谱条件： 色谱柱规格为2.1100mm， 1.7 m； 柱温40， 进样量4 L， 流速0.25mL/min；以0.1%甲酸水溶液为流动相A， 以乙腈为流动相B进行梯度洗脱， 洗脱的程序为： 010min，5%15%B； 1020min， 15%25%B； 2030min， 25%45%B； 3032min， 45%47%B； 3235min， 47%B； 3540min， 47%50%B； 4045min， 50%55%B； 4550min， 55%95%B ； 5052min， 95%B； 5252.1min， 95%5%B； 52.155min， 5%B；质谱条件： 采用ESI电喷雾离子源， 正离子模式检测； 质量扫描范围m/z1001000， 喷雾电压5.5kV， 离子源温度500， 去簇电压100 eV， 碰撞能量45eV， 碰撞能量叠加15eV， 气帘气压力40psi， 雾化气和辅助气压力均为50psi， 数据采集时间55min， 采用 TOF-MS-IDA-MS/MS 方式采集数据， IDA设置响应值超过100cps的6个最高峰进行二级质谱扫描， 子离子扫描范围m/z： 501000， 满足该条件的优先进行二级扫描， 开启动态背景扣除；获得化合物的总离子流图、 一级质谱信息和二级质谱信息。0008本发明中， 优选地， 所述步骤S3中， 通过数据库快速筛查和二级质谱分析， 从裂叶独活醇提取液快速鉴定多种香豆素类成分的具体方法为： 采用PeakView1.2软件对质谱的数据进行分析； 根据国内外专业数据库Pubmed、 ChemSpider、 Metlin、 中科院化学专业数据库及国内外裂叶独活及香豆素相关研究文献， 收集香豆素类化合物名称、 分子式及