【发明专利】高度稳定高生物安全性的壳聚糖纳米粒子及制法和应用 CN114470200A.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202111516498.3(22)申请日 2021.12.13(71)申请人 东南大学地址 211102 江苏省南京市江宁区东南大学路2号(72)发明人 林凤鸣章杰(74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204专利代理师 柏尚春(51)Int.Cl.A61K 41/00(2020.01)A61K 47/59(2017.01)A61K 47/61(2017.01)A61K 47/69(2017.01)A61P 31/04(2006.01)A61P 31/10(2006.01)B82Y 5/00(2011.01)A01N 25/10(2006.01)A01N 43/90(2006.01)A01P 1/00(2006.01)A01P 3/00(2006.01) (54)发明名称高度稳定高生物安全性的壳聚糖纳米粒子及制法和应用(57)摘要本发明提供了一种高稳定高生物安全性的壳聚糖纳米材料(CMCSPEIPpIX纳米粒子)的制备方法及其在广谱光动力抗微生物的应用。 以原卟啉(PpIX)和乙烯亚胺(PEI)为原材料， 通过一步水热法获得PEIPpIX。 再以PEIPpIX和羧甲基壳聚糖(CMCS)为原料， 通过EDC/NHS反应， 生成带负电荷的CMCSPEIPpIX。 CMCSPEIPpIX在溶液中自组装成纳米粒子， 并在溶液中显示出显着增强的单线态氧产量。 因此， CMCSPEIPpIX纳米粒子对革兰氏阴性菌、 革兰氏阳性菌、 真菌均具有很好的抗菌PDT活性， 同时对正常细胞无毒性且高度稳定。 本发明为食品、 医药用品以及食品、 医药加工环境中有效杀灭病害微生物提供了有效途径。权利要求书1页 说明书5页 附图6页CN 114470200 A2022.05.13CN 114470200 A1.一种高度稳定高生物安全性的壳聚糖纳米粒子， 其特征在于， 通过原卟啉PpIX、 乙烯亚胺PEI和羧甲基壳聚糖CMCS为原料制备而得。2.一种权利要求1所述的高度稳定高生物安全性的壳聚糖纳米粒子的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤：(1)将PpIX和PEI溶解于水中， 得到混合溶液， 并转入到水热釜中， 在120240下反应612h；(2)将步骤(1)中得到的反应产物用1k分子量透析袋在超纯水中透析1d后， 用0.45 m滤头过滤， 得到PEIPpIX溶液；(3)取5mL步骤(2)中得到的PEIPpIX溶液， 向其中加入羧甲基壳聚糖CMCS和1(3二甲氨基丙基)3乙基碳二亚胺盐酸盐； 在35下磁力搅拌1618h；(4)将步骤(3)中得到的反应产物用50k分子量透析袋在超纯水中透析1d后， 用0.45 m滤头过滤； 得到最终产物CMCSPEIPpIX纳米粒子。3.根据权力要求2所述的高度稳定高生物安全性的壳聚糖纳米粒子的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述PEI的平均分子量为6001000Da， 加入量为110g； 所述PpIX的加入量为120mg。4.根据权力要求2所述的高度稳定高生物安全性的壳聚糖纳米粒子的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述水热釜为为聚四氟乙烯内衬的高温高压水热反应釜， 反应釜容积为25100mL。5.根据权力要求2所述的高度稳定高生物安全性的壳聚糖纳米粒子的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 反应温度为180， 反应时间为8h。6.根据权力要求2所述的高度稳定高生物安全性的壳聚糖纳米粒子的制备方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 所述CMCS的加入量为120mg， 所述1(3二甲氨基丙基)3乙基碳二亚胺盐酸盐的加入量为10200 L。7.一种权利要求1所述的高度稳定高生物安全性的壳聚糖纳米粒子在广谱光动力抗微生物的应用。8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述抗微生物包括革兰氏阳性菌、 革兰氏阴性菌和真菌。9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述革兰氏阳性菌包括大肠杆菌、 变形杆菌、 粘质沙雷氏菌； 所述革兰氏阴性菌包括金黄色葡萄球菌、 表皮葡萄球菌、 藤黄微球菌。10.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述真菌包括酿酒酵母菌、 白色念珠菌。权利要求书1/1 页2CN 114470200 A2高度稳定高生物安全性的壳聚糖纳米粒子及制法和应用技术领域0001本发明属于纳米材料与生物技术领域， 尤其涉及一种高度稳定高生物安全性的壳聚糖纳米粒子及制法和应用。背景技术0002光动力抗微生物法(Antimicrobial Photodynamic Therapy， PDT)是利用光敏剂在 光 照 射 下 产 生 活 性 氧 (R O S) ， 如 单 线 态 氧 (1O2) 和 自 由 基 来 杀 死 微 生 物(Chem .Soc .Rev .2010 ,39 ,28352846)。 产生的ROS会破坏关键生物分子， 包括脂质(Chem.Sci.2020,11,34053417)、 蛋白质(J.Am.Chem.Soc.2016,138,1096810977)和核酸(J .Biol .Chem .2001 ,276 ,605640604) ， 导致细胞坏死/凋亡和组织损伤(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2019,58,25582569)。 PDT是一种对抗微生物感染的有效方法，被认为是替代传统抗生素以消灭正常和耐药微生物的潜在策略(Curr.Opin.Microbiol.2016,33,6773)。 据报道， 对抗生素具有耐药性的微生物对PDT表现出与非耐药微生物相同的脆弱性(Accounts Chem.Res.2017,50,27272736)。 此外， 因其通常通过破坏微生物的生物大分子来消灭微生物， PDT被认为不易产生抗生素抗性(Curr.Opin.Microbiol.2016,33,6773)。0003由于单线态氧和羟基自由基半衰期短且反应性强， PDT只能破坏光敏剂附近的结构和分子。 在生物系统中， 根据单线态氧的半衰期在40ns内， 计算出光敏剂的作用半径在20nm以内(Photochem.Photobiol.1991,53,549553)。 因此， 光敏剂的位置对于抗菌PDT的效率非常重要。 为了达到满意的抗菌PDT效果， 需要光敏剂能够锚定在微生物细胞表面和/或进入细胞。 然而， 由于其疏水性和低水溶性， 大多数光敏剂不能附着到细胞表面和/或渗透到细胞中(Acta.Pharm.Sin.B.2016,6,297307)， 这严重损害了它们的抗菌PDT效率。 为了克服这个问题， 已经通过物理封装和化学方法为光敏剂开发了各种纳米载体复合物， 包括脂质体、 金属纳米粒子 (Acs Nano 2013 ,7 ,53205329) 、 聚合物纳米粒子(Int.J.Biol.Macromol.2021,167,4658)、 上转换纳米粒子(Biomater.SciUk.2017,5,678685)等。 但这些已有的纳米复合物存在抗微生物活性低、 生物相容性差和合成方法复杂等问题亟待解决的问题。0004此外 ， PDT对革兰氏 阴性菌 和真菌的 抗菌 作 用通常 低于革兰氏 阳性菌(Antimicrob.Agents.Ch.2017,61,7)。 革兰氏阴性菌的细胞壁结构比革兰氏阳性菌多了一层外膜， 成为光敏剂进入细胞的屏障(J.Appl.Microbiol.2013,114,3643)。 因此， 提高PDT对革兰氏阴性菌的杀菌活性成为研究焦点。0005目前已有主要相关研究集中在提高整个PDT给药体系的正电荷以实现革兰氏阴性菌的光灭活， 这是因为带正电荷的化合物可以通过静电相互作用与外膜中的阴离子脂多糖有效 相互 作 用。 一 种方法是 利 用具有本身带正电 荷的 光敏剂 ， 例如甲 苯胺蓝O(Biomater.SciUk.2017,5,678685)、 亚甲蓝(Biomater.SciUk.2017,5,678685)等。 另一 种 方 法 是 将 光 敏 剂 与 阳 离 子 试 剂 结 合 ，例 如 聚 乙 烯 亚 胺 ( P E I )说明书1/5 页3CN 114470200 A3(Antimicrob.Agents.Ch.2006,50,14021410)、 聚赖氨酸(Las.Med.Sci.2013,28,465471)和多粘菌素B(Photochem.Photobiol.1992,55,8996)。 然而， 这些策略存在细胞毒性大、 生物相容性差的问题。 例如， 以PEI为代表的大多数阳离子试剂对哺乳动物细胞有害， 尤其是红细胞， 这可能会引起免疫原性反应(J.Control.Release.2015,220,447455)。 另一方面， 尽管全球范围内严重的真菌感染和真菌抗生素耐药性不断上升， 开发抗真菌疗法却极其困难(Mycoses.2011,54,E265E271)。 这是因为与细菌是原核生物不同， 真菌是真核生物(Exp.Ther.Med.2016,12,2327)。 因此， 迫切需要建立新的抗真菌治疗策略。 总之， 通过提高光敏剂溶解度构建高生物安全性的广谱抗菌PDT策略， 对于抗微生物感染具有重要实际应用价值。发明内容0006发明目的： 本发明的目的在于提供一种高度稳定高生物安全性的壳聚糖纳米粒子， 以解决光敏剂水溶性差、 细胞相互作用弱的问题， 提高光动抗菌活性， 开发高效、 安全、稳定的广谱PDT抗微生物药物， 用于应对日益严峻的微生物耐药性导致的抗微生物药物的缺乏； 本发明还提供这种纳米粒子的制备和应用。0007技术方案： 本发明的高度稳定高生物安全性的壳聚糖纳米粒子， 通过原卟啉PpIX、乙烯亚胺PEI和羧甲基壳聚糖CMCS为原料制备而得。0008本发明还提供高度稳定高生物安全性的壳聚糖纳米粒子的制备方法， 原卟啉(PpIX)首先通过水热法与带正电荷的PEI连接形成PEIPpIX， 以提高PpIX的水溶性并增强PpIX与微生物的相互作用。 然后， PEIPpIX进一步与羧甲基壳聚糖(CMCS)进行化学偶联， 以解决PEI引起的细胞毒性问题， 生成带负电荷的CMCSPEIPpIX。 CMCSPEIPpIX在溶液中自组装成纳米颗粒， 并在溶液中显示出显着增强的单线态氧产量。 因此， CMCSPEIPpIX纳米粒子对革兰氏阴性菌、 革兰氏阳性菌、 真菌均具有很好的抗菌PDT活性， 同时对正常细胞无毒性且高度稳定。0009具体包括如下步骤：0010(1)将PpIX和PEI溶解于水中， 得到混合溶液， 并转入到水热釜中， 在120240下反应612h；0011(2)将步骤(1)中得到的反应产物用1k分子量透析袋在超纯水中透析1d后， 用0.45 m滤头过滤， 得到PEIPpIX溶液；0012(3)取5mL步骤(2)中得到的PEIPpIX溶液， 向其中加入羧甲基壳聚糖CMCS和1(3二甲氨基丙基)3乙基碳二亚胺盐酸盐； 在35下磁力搅拌1618h；0013(4)将步骤(3)中得到的反应产物用50k分子量透析袋在超纯水中透析1d后， 用0.45 m滤头过滤； 得到最终产物CMCSPEIPpIX纳米粒子。0014进一步地， 步骤(1)中， 所述PEI的平均分子量为6001000Da， 加入量为110g； 所述PpIX的加入量为120mg。0015进一步地， 步骤(1)中， 所述水热釜为为聚四氟乙烯内衬的高温高压水热反应釜，反应釜容积为25100mL。0016进一步地， 步骤(1)中， 反应温度为180， 反应时间为8h。0017进一步地， 步骤(3)中， 所述CMCS的加入量为120mg， 所述1(3二甲氨基丙基)3说明书2/5 页4CN 114470200 A4乙基碳二亚胺盐酸盐的加入量为10200 L。0018本发明的高度稳定高生物安全性的壳聚糖纳米粒子可以应用于广谱光动力抗微生物领域。0019进一步地，