【发明专利】高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株及其构建方法和应用 CN111440807A.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010264312.9(22)申请日 2020.04.07(71)申请人 上海海洋大学地址 201306 上海市浦东新区沪城环路999号(72)发明人 谢喆闫方方方家松(74)专利代理机构 上海伯瑞杰知识产权代理有限公司 31227代理人 周一新(51)Int.Cl.C12N 15/31(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12N 15/74(2006.01)C12N 9/08(2006.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株及其构建方法和应用(57)摘要本发明属于基因工程技术领域， 公开了高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株及其构建方法和应用， 以希瓦氏菌株WP34RE为出发菌株， 敲除oxyR基因(如SEQIDNO:1所示)内的部分基因片段(如SEQIDNO:6所示)， 解除对过氧化氢酶基因表达的抑制作用， 得到基因突变菌株oxyRc； 同时优化oxyRc发酵生产低温过氧化氢酶的工艺提高产量。 相比于WP34RE， oxyRc的过氧化氢酶产量提高了3098倍， 其胞内酶活可达34133U/mL， 比活力达19022U/mg， 用于提高纺织、 造纸、 食品和医药领域所需低温过氧化氢酶的产量， 克服野生菌株生产低温过氧化氢酶产量较低的问题。权利要求书2页 说明书6页序列表2页 附图2页CN 111440807 A2020.07.24CN 111440807 A1.一种oxyR基因， 具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的oxyR基因， 其特征在于， 所述oxyR基因来源于希瓦氏菌株WP34RE。3.根据权利要求2所述的oxyR基因， 其特征在于， 所述oxyR基因中负责响应H2O2的序列片段如SEQ ID NO:6所示。4.一种高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株， 其特征在于， 所述突变菌株通过包括如下步骤的方法制得： 以希瓦氏菌株WP34RE为出发菌株， 敲除所述oxyR基因中负责响应H2O2的序列片段， 相应获得基因突变菌株oxyRc； 所述基因突变菌株oxyRc即为高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株。5.根据权利要求4所述的希瓦氏菌WP3突变菌株， 其特征在于， 所述oxyR基因如权利要求13任一项所述， 和/或所述被敲除的负责响应H2O2的序列片段如权利要求3所述。6.权利要求4或5所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株的构建方法， 其特征在于， 包括以下步骤：(1)根据权利要求13任一项所述oxyR基因设计基因敲除引物； 和(2)以所述希瓦氏菌株WP34RE为出发菌株， 敲除所述oxyR基因中负责响应H2O2的序列片段， 相应获得基因突变菌株oxyRc， 所述基因突变菌株oxyRc即为权利要求4或5所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株。7.根据权利要求6所述希瓦氏菌WP3突变菌株的构建方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述引物包括上游引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示、 下游引物如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。8.根据权利要求6所述希瓦氏菌WP3突变菌株的构建方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述敲除包括如下步骤：(a)PCR扩增所述oxyR基因所敲除片段上下游同源臂， 通过融合PCR获得大片段；(b)连接所述大片段与自杀质粒得重组质粒， 将所述重组质粒转化到供体菌E.coli WM3064；(c)供体菌E.coli WM3064与受体菌WP34RE进行细菌接合转移；(d)单交换克隆子及双交换克隆子的筛选、 测序鉴定， 得到基因突变菌株oxyRc。9.根据权利要求8所述希瓦氏菌WP3突变菌株的构建方法， 其特征在于， 所述自杀质粒为pRE112质粒。10.根据权利要求8所述希瓦氏菌WP3突变菌株的构建方法， 其特征在于， 步骤(d)中， 所述鉴定具体指设计如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的引物进行PCR扩增和测序鉴定。11.权利要求13任一项所述oxyR基因、 权利要求4或5所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株在纺织、 造纸、 食品和医药领域提高低温过氧化氢酶产量中的应用。12.权利要求4或5所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株发酵生产低温过氧化氢酶的方法， 其特征在于， 包括步骤：( )将所述基因突变菌株oxyRc接种至液体培养基中活化培养至对数中后期； 和()以对数中后期1的接种量转接至发酵培养基中振荡发酵培养1236h。13.根据权利要求12所述发酵生产低温过氧化氢酶的方法， 其特征在于， 所述发酵培养时间为24h， 和/或权利要求书1/2 页2CN 111440807 A2所述发酵培养基内含有0.5mM的FeCl3。权利要求书2/2 页3CN 111440807 A3高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株及其构建方法和应用技术领域0001本发明属于基因工程技术领域， 涉及一种高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株及其构建方法和应用， 具体是以高接合转移率的希瓦氏菌株WP34RE为出发菌株，敲除其oxyR基因中负责响应H2O2的序列片段， 获得高产低温过氧化氢酶的基因突变菌株oxyRc。背景技术0002过氧化氢酶(Catalase)普遍存在于微生物， 植物和动物体内。 它可以快速的催化H2O2分解成为H2O和O2， 是一种重要的工业酶制剂， 在食品、 造纸、 农业、 环保和医药产业中具有广阔的应用价值。 目前， 市场上的商品化过氧化氢酶大多是中温和高温过氧化氢酶， 低温过氧化氢酶还有待进一步开发和应用。0003研究发现， 一株深海希瓦氏菌Shewanella piezotolerans WP3的过氧化氢酶属于低温过氧化氢酶， 此酶的最适温度在4-10之间， 通过重组大肠杆菌生产的该重组过氧化氢酶酶活力达45318U/mg； 但是， 大肠杆菌本身产生的热源、 内毒素不易除去， 产品纯化问题较多， 在生产的过程中发现有包涵体的形成， 对工业化高水平的生产带来一定的困难。 直接利用WP3发酵生产此过氧化氢酶对酶的稳定性更为有利， 且WP3为非致病菌， 细胞较大肠杆菌更容易破碎， 回收和纯化蛋白较为简单。 然而直接利用野生菌株WP3生产过氧化氢酶产量较低， 虽然可以通过育种技术对野生菌株进行筛选， 但工作量较大且难以得到理想的突变菌株。 因此， 利用基因工程技术将野生菌株改造成高产过氧化氢酶的菌株成为一种快速而高产过氧化氢酶的途径。发明内容0004为克服现有技术的上述不足， 本发明提供了一种oxyR基因， 具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。0005根据所述oxyR基因的一些实施方式， 所述oxyR基因来源于深海的希瓦氏菌株WP34RE。0006根据所述oxyR基因的一些实施方式， 所述oxyR基因内负责响应H2O2的序列片段如SEQ ID NO:6所示。0007本发明还提供了一种高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株， 所述突变菌株通过包括如下步骤的方法制得： 以希瓦氏菌株WP34RE为出发菌株， 敲除所述WP34RE菌株的oxyR基因内负责响应H2O2的序列片段， 相应获得基因突变菌株oxyRc； 所述基因突变菌株oxyRc即为高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株。0008根据本发明所述希瓦氏菌WP3突变菌株的一些实施方式， 所述oxyR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。0009根据本发明所述希瓦氏菌WP3突变菌株的一些实施方式， 所述被敲除的负责响应说明书1/6 页4CN 111440807 A4H2O2的序列片段如SEQ ID NO:6所示。0010本发明还提供了所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株的构建方法，包括步骤：0011(1)根据所述oxyR基因设计基因敲除引物； 和0012(2)以所述希瓦氏菌株WP34RE为出发菌株， 敲除所述oxyR基因中负责响应H2O2的序列片段， 相应获得基因突变菌株oxyRc， 所述基因突变菌株oxyRc即为所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株。0013根据本发明所述WP3突变菌株的构建方法的一些实施方式， 步骤(1)中， 所述引物包括上游引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示， 下游引物如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。0014根据本发明所述WP3突变菌株的构建方法的一些实施方式， 步骤(2)中， 所述敲除包括如下步骤：0015(a)PCR扩增所述oxyR基因所敲除片段上下游同源臂， 通过融合PCR获得大片段；0016(b)连接所述大片段与自杀质粒得重组质粒， 将所述重组质粒转化到供体菌E.coli WM3064；0017(c)供体菌E.coli WM3064与受体菌WP34RE进行细菌接合转移；0018(d)单交换克隆子及双交换克隆子的筛选、 测序鉴定， 得到oxyR基因突变菌株oxyRc。0019根据本发明所述WP3突变菌株的构建方法的一些实施方式， 所述自杀质粒为pRE112质粒。0020根据本发明所述WP3突变菌株的构建方法的一些实施方式， 步骤(d)中， 所述鉴定具体指设计如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的引物进行PCR扩增和测序鉴定。0021本发明还提供了所述oxyR基因或所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株在纺织、 造纸、 食品和医药领域提高低温过氧化氢酶产量中的应用。0022本发明还提供了所述突变菌株oxyRc发酵生产低温过氧化氢酶的方法， 包括步骤： ( )将所述突变菌株oxyRc接种至液体培养基中活化培养至对数中后期； 和()以对数中后期1的接种量转接至发酵培养基中振荡发酵培养1236h。0023根据本发明所述突变菌株oxyRc发酵生产低温过氧化氢酶的一些实施方式， 所述发酵培养时间为24h。0024根据本发明所述突变菌株oxyRc发酵生产低温过氧化氢酶的一些实施方式， 所述发酵培养基内含有0.5mM的FeCl3。0025与现有技术相比， 本发明的有益效果在于：00261.本发明以希瓦氏菌株WP34RE为出发菌株， 通过敲除WP34RE菌株中抑制过氧化氢酶基因表达的oxyR基因部分片段， 相应获得基因突变菌株oxyRc， 使其解除对过氧化氢酶基因表达的抑制作用， 从而提高低温过氧化氢酶的产量； 相比于出发菌株WP34RE， 基因突变菌株oxyRc的过氧化氢酶产量提高了3098倍， 其胞内酶活可达34133U/mL， 比活力达19022U/mg。00272.本发明通过基因工程构建高产低温过氧化氢酶的WP3突变菌株， 并对其发酵生产过氧化氢酶的条件进行优化， 为提高纺织、 造纸、 食品和医药领域所需低温过氧化氢酶的说明书2/6 页5CN 111440807 A5产量提供新的途径， 克服野生菌株生产低温过氧化氢酶产量较低的问题。附图说明0028通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述， 本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：0029图1为希瓦氏菌株WP34RE和基因突变菌株oxyRc的oxyR基因序列比对图。0030图2为基因突变菌株oxyRc生产低温过氧化氢酶的发酵时间优化。0031图3为基因突变菌株oxyRc生产低温过氧化氢酶的发酵培养基优化。具体实施方式0032下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。 以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明， 但不以任何形式限制本发明。 应当指出的是， 对本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进。 这些都属于本发明的保护范围。0033实施例1基因突变菌株oxyRc的构建0034构建基因突变菌株oxyRc， 具体步骤为： (1)设计含KpnI和Sa