【发明专利】一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR-T细胞及其制备方法 CN114934019A.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202111282362.0(22)申请日 2021.11.01(71)申请人 南京蓝盾生物科技有限公司地址 210000 江苏省南京市栖霞区纬地路9号江苏生命科技园B5栋6楼(72)发明人 李俊郭志刚(74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204专利代理师 曹坤(51)Int.Cl.C12N 5/10(2006.01)C07K 16/28(2006.01)C07K 19/00(2006.01)C12N 15/13(2006.01)C12N 15/62(2006.01)C12N 15/867(2006.01)A61K 39/00(2006.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR-T细胞及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CART细胞及其制备方法。 属于医药生物领域， 其中， 所述CART细胞同时表达MSLNCAR和PD1抗体； 步骤： 构建重组慢病毒质粒； 制备重组慢病毒； 分离、 活化T细胞； 将重组慢病毒感染T细胞； CART细胞体外培养； CART细胞扩增； 收集CART细胞。 本发明分泌的PD1抗体， 能够特异性的与T细胞表面的PD1相结合， 阻断肿瘤微环境中PD1/PDL1通路对T细胞的抑制作用， 进而增强CART对肿瘤细胞的杀伤效果。 本发明还涉及自分泌PD1抗体的靶向人Mesothelin的CART细胞在抗肿瘤免疫治疗药物中的应用。权利要求书1页 说明书11页 附图3页CN 114934019 A2022.08.23CN 114934019 A1.一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CART细胞， 其特征在于， 所述CART细胞同时表达MSLNCAR和PD1抗体；其中， 所述PD1抗体的氨基酸序列如SEQ NO.1所述；所述表达的MSLNCAR和PD1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所述；核酸序列如SEQ ID NO.9所述。2.根据权利要求1所述的一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CART细胞， 其特征在于， 所述MSLNCAR包括信号肽、 胞外区、 铰链区、 跨膜区、 共刺激信号域及胞内信号结构域。3.根据权利要求2所述的一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CART细胞， 其特征在于，所述的信号肽为CD8a信号肽， 其氨基酸序列如SEQ NO.2所述；所述胞外区为靶向mesothelin的scfv， 其氨基酸序列如SEQ NO.3所述；所述铰链区为CD8a， 其氨基酸序列如SEQ NO.4所述；所述跨膜区为CD8a， 其氨基酸序列如SEQ NO.5所述；所述共刺激信号域为41BB， 其氨基酸序列如SEQ NO.6所述；所述胞内信号结构域为CD3zeta， 其氨基酸序列如SEQ NO.7所述。4.如权利要求13所述的一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CART细胞制备方法，其特征在于， 具体制备步骤如下：(1)、 构建携带MSLNCAR及PD1抗体核酸序列的重组慢病毒质粒；(2)、 将携带MSLNCAR及PD1抗体的的重组慢病毒质粒及辅助质粒转染宿主细胞， 制备可感染T细胞的重组慢病毒；(3)、 从供者提供的外周血中分离PBMC， 使用磁珠分离、 活化T细胞；(4)、 将制备的可感染T细胞的重组慢病毒感染T细胞， 产生表达MSLNCAR的同时分泌PD1抗体的CART细胞；(5)、 将得到的CART细胞进行体外培养；(6)、 将进行了体外培养的CART细胞进行扩增；(7)、 收集表达MSLNCAR的同时分泌PD1抗体的CART细胞。5.根据权利要求4所述的一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CART细胞制备方法，其特征在于， 在步骤(1)中， 所述重组慢病毒质粒是： 重组后的复制缺陷型慢病毒质粒， 能将外源片段整合入宿主基因； 所述重组慢病毒质粒是二代或三代的慢病毒转基因质粒。6.根据权利要求4所述的一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CART细胞制备方法，其特征在于， 在步骤(2)中， 所述制备可感染T细胞的重组慢病毒载体具体是： 重组慢病毒载体将靶向MSLN的嵌合受体表达在T细胞表面， 同时分泌PD1抗体；其中， 所述的PD1抗体为人PD1抗体。7.根据权利要求4所述的一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CART细胞制备方法，其特征在于， 在步骤(2)中， 所述的宿主细胞是： 293FT或293T细胞。权利要求书1/1 页2CN 114934019 A2一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CART细胞及其制备方法技术领域0001本发明属于医药生物领域， 涉及一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的 CART细胞及其制备方法。背景技术0002嵌合抗原受体(CAR)是模拟T细胞受体功能的人工受体， 其融合了抗原与抗体或配体与受体的识别和结合特异性以及效应T细胞对被识别的肿瘤细胞的杀伤能力； CAR由CD8a引导肽、 抗原识别区(配体或单链抗体或Fab片段)、 跨膜区、 以及T细胞的一系列信号转导区(CD28， CD3， CD137胞内信号传导结构域)依次连接而成。 T细胞经修饰后， 表面表达的CAR首先通过抗原识别区与肿瘤细胞表面抗原结合， 然后通过其信号转导区将活化信号传递至胞内， 靶向地激活T细胞对肿瘤细胞杀伤活性。 将表达CAR的DNA序列克隆入慢病毒表达载体，并感染从患者血中分离出的T细胞， 使T细胞表面表达相应的CAR， 再将此修饰的T细胞再输回患者体内， 修饰后的T细胞可以在患者体内靶向性地杀伤表达相关抗原的肿瘤细胞， 达到清除肿瘤细胞的效果。0003虽然CART细胞免疫治疗在动物模型和患者身上表现了令人振奋的作用， 但二代、三代CART细胞在实体瘤治疗领域仍面临巨大挑战， 主要包括： 缺乏肿瘤特异性抗原， 从而存在攻击正常细胞引起严重副反应的风险； T细胞难以有效的到达肿瘤部位， CART细胞浸润实体瘤的能力不足、 存活时间短， 以及一系列的免疫抑制分子及免疫抑制肿瘤微环境等均会限制CART细胞的抗肿瘤疗效， 如T细胞膜蛋白3(TIM3)、 淋巴细胞激活因子3(LAG3)、细胞毒性T 淋巴细胞4(CTLA4)、 程序性细胞死亡蛋白1(PD1)及其两个主要配体PDL1、 PDL2等。0004肿瘤抑制性免疫微环境是CART在实体瘤中疗效不佳的重要原因。 程序性死亡受体1(PD1)是T细胞活化的负调节， 通过与其两个配体PDL1、 PDL2 相互作用来限制T细胞的活性。 抑制免疫负调控取得了突破性进展， 例如抗 CTLA4、 抗PD1、 抗PDL1等免疫检查点单抗阻断质量， 开创了癌症治疗新时代。 目前应用于临床研究的PD1或者PDL1抗体， 通过阻断PD1或者PDL1 通路， 部分恢复T细胞的功能， 使其能够继续杀伤肿瘤细胞具有治疗多种类型肿瘤的潜力。 恶性黑色素瘤、 非小细胞肺癌、 头颈鳞状上皮细胞癌、 霍奇金淋巴瘤、肾细胞癌、 结直肠癌、 卵巢癌等都均显示良好的临床疗效。 且PD1和PDL1 的单抗已被美国食品药品监督局(FDA)批准用于复发或难治性恶性黑色素瘤或非小细胞肺癌的治疗。0005MESOTHELIN是一种肿瘤相关抗原， 在大多数的恶性胸膜间皮瘤、 胰腺癌、 卵巢癌及某些肺癌中有表达， 并且正常组织中表达范围窄、 表达量低。 因而可以作为恶性胸膜间皮瘤、 胰腺癌、 卵巢癌的免疫治疗靶点.0006本技术方案采用的是第四代的CAR结构， CART细胞在识别Mesothelin的同时能够分泌PD1抗体， 分泌的PD1抗体可以阻断肿瘤细胞表面PDL1分子与CART细胞的结合， 从而解除PDL1对CART细胞的抑制作用， 本技术方案因此能够提高CART细胞对肿瘤细胞的说明书1/11 页3CN 114934019 A3杀伤作用。发明内容0007发明目的： 本发明的目的是提供了一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的 CART细胞及其制备方法。0008技术方案： 在本发明的第一方面， 本发明提供了一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CART细胞，0009包括如下细胞：0010表达MSLNCAR的T细胞；0011表达MSLNCAR的同时分泌PD1抗体的T细胞； 在本发明中， 术语MSLN CAR指MSLN嵌合抗原受体， 包含有靶向MSLN的scFv序列；0012scFv序列： 全称singlechain antibody fragment， 即单链抗体片段；0013在本发明中， 术语MSLNscFv指抗MSLN单链抗体片段， 氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；0014所述CART细胞用于分泌PD1抗体(所述CART细胞表达MSLNCAR的同时分泌PD1抗体)； 即所述CART细胞同时表达MSLNCAR和PD1抗体；0015其中， 所述PD1抗体的氨基酸序列如SEQ NO.1所述；0016所述表达的MSLNCAR和PD1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所述；0017核酸序列如SEQ ID NO.9所述。0018进一步的， 所述MSLNCAR包括信号肽、 胞外区、 铰链区、 跨膜区、 共刺激信号域及胞内信号结构域。0019进一步的， 所述的信号肽为CD8a信号肽， 其氨基酸序列如SEQ NO.2所述；0020所述胞外区为靶向mesothelin的scfv， 其氨基酸序列如SEQ NO.3所述；0021所述铰链区为CD8a， 其氨基酸序列如SEQ NO.4所述；0022所述跨膜区为CD8a， 其氨基酸序列如SEQ NO.5所述；0023所述共刺激信号域为41BB， 其氨基酸序列如SEQ NO.6所述；0024所述胞内信号结构域为CD3zeta， 其氨基酸序列如SEQ NO.7所述。0025进一步的 ， 在本发明的第二方面， 本发明提供了一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CART细胞制备方法， 具体制备步骤如下：0026(1)、 构建携带MSLNCAR及PD1抗体核酸序列的重组慢病毒质粒；0027(2)、 将携带MSLNCAR及PD1抗体的的重组慢病毒质粒及辅助质粒转染宿主细胞，制备可感染T细胞的重组慢病毒；0028(3)、 从供者提供的外周血中分离PBMC， 使用磁珠分离、 活化T细胞；0029(4)、 将制备的可感染T细胞的重组慢病毒感染T细胞， 产生表达 MSLNCAR的同时分泌PD1抗体的CART细胞；0030(5)、 将得到的CART细胞进行体外培养；0031(6)、 将进行了体外培养的CART细胞进行扩增；0032(7)、 收集表达MSLNCAR的同时分泌PD1抗体的CART细胞。0033进一步的， 在步骤(1)中， 所述重组慢病毒质粒是： 重组后的复制缺陷型慢病毒质说明书2/11 页4CN 114934019 A4粒， 能将外源片段整合入宿主基因； 一次性使用， 无法复制和增殖， 安全可靠； 所述重组慢病毒质粒是二代或三代的慢病毒转基因质粒， 优选为第三代慢病毒转基因质粒。0034进一步的， 在步骤(2)中， 所述制备可感染T细胞的重组慢病毒载体具体是： 重组慢病毒载体将靶向MSLN的嵌合受体表达在T细胞表面， 同时分泌PD1 抗体；0035其中， 所述的PD1抗体为人PD1抗体。0036进一步的， 在步骤(2)中， 所述的宿主细胞是： 293FT或293T细胞。0037进一步的， 在本发明的第三方面， 本发明提供了本发明中的PD1抗体 (antiPD1)的scFv由抗体重链可变区和轻链可变区通过1520个氨基酸的短肽连接而成， scFv能够较好的保留其对抗原的亲和力， 并具有分子量小、 穿透力强和抗原性弱等特点。0038进一步的， 本发明所述MSLNCAR的胞膜外肿瘤相关抗原结合区为用于结合MSLN蛋白的M