【发明专利】一种分析CD303+树突状细胞亚群表型和功能的方法及试剂盒 CN114391102A.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202180002895.0(22)申请日 2021.05.27(85)PCT国际申请进入国家阶段日2021.10.13(86)PCT国际申请的申请数据PCT/CN2021/096525 2021.05.27(71)申请人 中科蓝华 （广州） 生物医药技术有限公司地址 510555 广东省广州市广州中新广州知识城九佛建设路115号393房(72)发明人 周放陈小平秦莉胡晓晶高素素常旭谢简明黄烁珊容志恩牛欢(74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司 11332代理人 刘明海胡彬(51)Int.Cl.G01N 33/569(2006.01)G01N 33/58(2006.01)G01N 33/68(2006.01)G01N 15/14(2006.01) (54)发明名称一种分析CD303+树突状细胞亚群表型和功能的方法及试剂盒(57)摘要本申请提供了一种分析CD303+树突状细胞亚群表型和功能的方法及试剂盒。 所述试剂盒包括CD303、 CD205、 CD103、 IL12和TGF的特异性抗体组成的抗体组合配方， 其检测对象包括CD303、 CD205、 CD103、 IL12和TGF。 本申请的检测试剂盒可用于高效快速地鉴别外周血中CD303+树突状细胞亚群表型同时分析其功能， 保证准确率的同时降低因检测大量表面抗原分子导致的经济成本， 且检测方法简单易行。权利要求书2页 说明书7页 附图3页CN 114391102 A2022.04.22CN 114391102 A1.一种用于分析CD303+树突状细胞亚群表型和功能的抗体组合配方， 其包括： CD303抗体、 CD205抗体、 CD103抗体、 IL12抗体和TGF 抗体。2.如权利要求1所述的抗体组合配方在分析CD303+树突状细胞亚群表型和功能或制备分析CD303+树突状细胞亚群表型和功能的产品中的应用。3.根据权利要求2所述的应用， 其中， 所述产品包括试剂盒和/或检测试剂。4.一种分析CD303+树突状细胞亚群表型和功能的试剂盒， 其包括如权利要求1所述的抗体组合配方；其中， 所述抗体组合配方由五种不同的荧光色素进行标记。5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其中， 所述荧光色素选自BV421、 BV711、 PerCPCy5.5、Pacific blue、 PECF594、 FITC、 PECy7、 Amcyan、 APCCy7或QDot中的任意五种， 优选为BV421、 BV711、 PerCPCy5.5、 Pacific blue和PECF594。6.一种鉴定CD303+树突状细胞亚群表型和功能的方法， 其采用如权利要求1所述的抗体组合配方或如权利要求4或5所述的试剂盒进行检测， 所述方法包括：将待测细胞与不同荧光色素标记的CD205抗体、 CD103抗体和CD303抗体混合， 进行首次孵育， 染色， 固定； 以及将所得细胞进行透化处理， 再与不同荧光色素标记的IL12抗体和TGF 抗体混合， 进行再次孵育。7.根据权利要求6所述的方法， 其中， 所述方法包括如下步骤：(1)预处理外周血， 分离得到树突状细胞后加入白细胞刺激因子；(2)将步骤(1)得到的细胞染色， 加入不同荧光色素标记的CD205抗体、 CD103抗体和CD303抗体进行首次孵育， 再次染色， 而后将得到的细胞用福尔马林溶液固定；(3)将步骤(2)所得的细胞重悬于细胞穿透液， 离心后将沉淀的细胞再次重悬于细胞穿透液， 加入不同荧光色素标记的IL12抗体和TGF 抗体， 进行再次孵育；(4)将步骤(3)所得的细胞重悬于细胞穿透液中， 离心后将沉淀细胞重悬于细胞染色液， 用流式细胞仪进行分析检测， 得到CD303+树突状细胞亚群表型和功能。8.根据权利要求7所述的方法， 其中， 步骤(1)所述外周血的体积为10100 L；优选地， 步骤(1)所述白细胞刺激因子的体积浓度为0.080.1；优选地， 步骤(2)所述首次孵育的时间为2060min， 优选为2535min；优选地， 步骤(2)所述首次孵育的温度为1628；优选地， 步骤(2)所述福尔马林溶液的质量分数为24；优选地， 步骤(3)所述再次孵育的条件为4避光孵育1015h或1628避光孵育2040min。9.根据权利要求7或8所述的方法， 其中， 所述分析检测包括如下步骤：通过CD303抗体得到CD303分子的表达情况， 分析树突状细胞亚群表型CD303+的比例；通过CD103抗体和CD205抗体得到CD103分子和CD205分子的表达情况， 分析CD303+树突状细胞亚群的分化成熟状况； 和通过IL12抗体和TGF 抗体得到IL12分子和TGF 分子的分泌表达情况， 分析CD303+树突状细胞亚群的功能。10.根据权利要求69任一项所述的方法， 其中， 所述方法具体包括如下步骤：权利要求书1/2 页2CN 114391102 A2(1)取10100 L外周血进行抗凝处理， 外周血全血混合红细胞裂解液中， 旋转震荡后，静置1015min， 离心弃上清， 将沉淀细胞重悬于细胞染色液中， 按照体积浓度0.080.1加入白细胞刺激因子， 并在3037下孵育46h；(2)将步骤(1)得到的细胞与不同荧光色素标记的CD103、 CD205和CD303抗体混合进行孵育， 1628下孵育2535min， 再次染色， 将得到的细胞用质量分数为24的福尔马林溶液固定， 1628下避光孵育1520min；(3)将步骤(2)所得的细胞重悬于细胞穿透液中， 离心弃上清， 将沉淀的细胞重悬于细胞穿透液， 加入不同荧光色素标记的IL12和TGF 抗体， 在4避光条件下孵育1015h；(4)将步骤(3)孵育好的细胞重悬于细胞穿透液， 离心去上清， 将沉淀细胞重悬于细胞染色液， 用流式细胞仪进行分析检测；其中， 分析检测包括：通过CD303抗体得到CD303分子的表达情况， 分析树突状细胞亚群表型CD303+的比例；通过CD103抗体和CD205抗体得到CD103分子和CD205分子的表达情况， 分析CD303+树突状细胞亚群的分化成熟状况； 和通过IL12抗体和TGF 抗体得到IL12分子和TGF 分子的分泌表达情况， 分析CD303+树突状细胞亚群的功能。11.如权利要求4或5所述的试剂盒或如权利要求610任一项所述的方法在鉴定CD303+树突状细胞亚群和/或分析CD303+树突状细胞功能中的应用。权利要求书2/2 页3CN 114391102 A3一种分析CD303+树突状细胞亚群表型和功能的方法及试剂盒技术领域0001本申请属于生物技术领域， 具体涉及用流式细胞光度术进行免疫检测分析人外周血树突状细胞， 尤其涉及一种用于临床免疫检测分析CD303+树突状细胞亚群表型和功能的试剂盒及应用。背景技术0002树突状细胞(Dendritic cell， DC)作为体内免疫系统中起主要调控作用的细胞，是免疫学研究热点之一。 目前， 树突状细胞的检测主要依靠流式细胞分析技术， 但测定树突状细胞的分析方案多种多样， 没有统一的标准模式。 这主要是由于树突状细胞的研究日新月异， 多个不同的树突状细胞亚型已被报导发现； 而针对树突状细胞的流式细胞分析方案未免粗放， 已不能满足目前临床针对不同亚型的树突状细胞的精确分析要求。0003流式细胞仪(Flow cytometry)是对细胞进行自动分析和分选的装置， 主要由四部分组成， 包括流动室和液流系统、 激光源和光学系统、 光电管和检测系统以及计算机和分析系统。 流式细胞仪可以快速测量、 存贮、 显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、 生物化学方面的特征参量， 并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。 多数流式细胞仪是一种零分辨率的仪器， 它只能测量一个细胞的诸如总核酸量， 总蛋白量等指标。0004流式细胞仪可同时进行多参数测量， 信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。 其常用的技术指标有荧光分辨率、 荧光灵敏度、 适用样品浓度、 分选纯度、 可分析测量参数等。0005未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射， 因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。 在实际使用中， 仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时， 可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。 光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。 荧光信号主要包括两部分： 自发荧光， 即不经荧光染色， 细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光； 特征荧光， 即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光， 其荧光强度较弱， 波长也与照射激光不同。 自发荧光信号为噪声信号， 在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。0006在免疫细胞化学等测量中， 对于结合水平不高的荧光抗体来说， 如何提高信噪比是个关键。 一般说来， 细胞成分中能够产生的自发荧光的分子(例如核黄素、 细胞色素等)的含量越高， 自发荧光越强； 培养细胞中死细胞/活细胞比例越高， 自发荧光越强； 细胞样品中所含亮细胞的比例越高， 自发荧光越强。 减少自发荧光干扰、 提高信噪比的主要措施是： 尽量选用较亮的荧光染料； 选用适宜的激光和滤片光学系统； 采用电子补偿电路， 将自发荧光的本底贡献予以补偿。0007CD303+树突状细胞分布于人外周血中， 是近年来新发现的一个树突状细胞亚群。临床和基础研究表明， CD303+树突状细胞亚群在多种疾病的发生中起重要作用， 例如某些恶性肿瘤如肺癌， 黑色素瘤， 前列腺癌和肾癌， 皮炎， 某些病毒感染如HIV1感染， 某些传染说明书1/7 页4CN 114391102 A4病如疟疾感染以及一些自身免疫病如类风湿关节炎等； 在这些疾病中， CD303+树突状细胞都显现出表型和功能的异常。 因此， CD303+树突状细胞的表型和功能测定临床数据可成为临床医生判断上述疾病发展状况和临床治疗效果的辅助判断指标之一， 具有十分重要的临床诊断意义。0008通过流式细胞仪鉴定树突状细胞亚群通常需要分离提取外周血单核细胞， 该过程复杂繁琐， 时间周期长， 若通过细胞分子表面抗原检测的方式分析细胞亚群则通常选择大量树突状细胞表面抗原分子进行检测， 提高检测的准确性和特异性， 但大量表面抗原的检测分析需要较长时间并提高了检测的经济成本， 不利于快速高效地进行树突状细胞亚群分析研究。0009CN105911292A公开了一种用于组合分析CD11c+CD11b+树突状细胞亚群及其分化程度和功能的试剂盒， 包含以下8种抗体： CD11c、 CD80、 CD86、 CD11b、 HLADR、 IL12、 IL23和IL27。 该发明还提供了一种用于组合分析CD11c+CD11b+树突状细胞亚群及其分化程度和功能的方法， 可一次性地检测CD11c+CD11b+树突状细胞亚群及其分化程度和功能的全套数据。但树突状细胞的形态、 免疫功能不尽相同， 其表面抗原分子数量众多， 针对不同树突状细胞亚群需要选择不同的特异性检测分子。 例如， 研究表明CD11c+CD11b+DC亚群的功能与CD303+DC亚群的功能完全不同， 并且在不同的疾病中起用。 因此， 上述CD11c+CD11b+DC亚群检测试剂盒不能满足研究CD303+DC亚群的需要。0010有鉴于此， 研发提供一种用于鉴定CD303+树突状细胞亚群表型和功能的免疫检测试剂盒具有重要意义。发明内容0011本申请提供了一种用于分析CD303+树突状细胞(CD303+DC)亚群表型和功能的试剂盒及其应用。 所述方法中使用的针对CD303+DC亚群的抗体组合配方设计， 可高效快速地分析外周血中CD303+DC亚群表型及其功能， 保证准确率的同时也可降低因检测大量表面抗原分子导致的成本， 简单易行， 准确度高。0012第一方面， 本申请提供一种用于分析CD303+树