【发明专利】一种分离测定恩格列净及其有关物质的方法 CN106706768A.pdf

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510786031.9(22)申请日 2015.11.17G01N 30/02(2006.01)(71)申请人 重庆医药工业研究院有限责任公司地址 400061 重庆市南岸区涂山路 565 号(72)发明人 陈皓 李雪逃 刘泽荣 张道林冯浩 周冰 汪维维(54) 发明名称一种分离测定恩格列净及其有关物质的方法(57) 摘要本发明公开了一种分离测定恩格列净及其有关物质的方法， 该方法采用高效液相色谱法， 以辛烷基硅烷键合硅胶填料或苯基硅烷键合硅胶填料为色谱柱， 以磷酸溶液与甲醇、 乙腈组成流动相，进行梯度洗脱。该方法可以将恩格列净及其有关物质很好分离， 检测的重现性好、 灵敏度高、 专属性强、 操作简便， 有助于控制恩格列净的质量和用药安全。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书11页 附图2页CN 106706768 A2017.05.24CN 106706768 A1.一种用高效液相色谱法分离测定恩格列净及其有关物质的方法， 包括以辛烷基硅烷键合硅胶填料柱或苯基硅烷键合硅胶填料柱为色谱柱， 流动相由有机相和水相组成， 所述有机相为甲醇和乙腈混合溶液,水相为磷酸溶液或磷酸盐缓冲液， 所述磷酸溶液或磷酸盐缓冲液的pH值为26， 进行梯度洗脱， 以紫外检测器进行检测， 其中， 所述梯度洗脱包括水相与有机相的洗脱初始体积比为65354555， 水相与有机相的洗脱终止体积比为35651585。2.根据权利要求1所述的方法， 所述磷酸溶液或磷酸盐缓冲液的pH值为3.5。3.根据权利要求1或2所述的方法， 所述磷酸盐选自磷酸二氢钠、 磷酸二氢钾和磷酸二氢铵。4.根据权利要求1或2所述的方法， 水相中磷酸盐浓度为： 00.005mol/L。5.根据权利要求1所述的方法， 有机相中， 甲醇与乙腈的体积比为50： 50。6.根据权利要求1所述的方法， 所述梯度洗脱包括： 0min至第1824min时， 流动相中水相与有机相的体积比为60405050； 第1824min至第4854min时， 水相与有机相的体积比匀速变化至30702080； 第4854min至第5864min时水相与有机相的体积比保持比例不变。7.根据权利要求7所述的方法， 所述梯度洗脱包括： 0min至第19.5min时， 流动相中水相与有机相的体积比为5545； 第19.5min至第50min时， 水相与有机相的体积比匀速变化到2575； 第50min至第60min时水相与有机相的体积保持比例2575不变。8.根据权利要求1所述的方法， 进一步包括以下步骤：（1） 取恩格列净原料药或其药物组合物， 加流动相使恩格列净完全溶解并稀释定容， 配制成每1ml溶液中含恩格列净0.40.8mg， 滤过， 作为供试品溶液；（2） 以辛烷基硅烷键合硅胶填料柱或苯基硅烷键合硅胶填料柱为色谱柱， 流速为0.81.2ml/min， 柱温为2030， 波长为200250nm；（3） 取供试品溶液1030 l， 注入高效液相色谱仪；（4） 将水相pH26的磷酸溶液或磷酸盐缓冲液与有机相甲醇、 乙腈等以65354555为初始体积比洗脱至主峰出来后， 逐渐增大有机相比例， 至水相与有机相的体积比达到35651585并保持不少于10分钟， 完成恩格列净有关物质的测定；（5） 采用不加校正因子的主成分对照品法以峰面积计算恩格列净的纯度及有关物质中各单一杂质含量及有关物质总量。9.根据权利要求9所述的方法， 步骤 （1） 中， 每1ml溶液中含恩格列净0.8mg， 或步骤 （2）中流速为1.0ml/min， 柱温为25， 波长为224nm， 或步骤 （3） 中， 取供试品溶液20 l， 或步骤（4） 中水相为pH3.5的磷酸溶液或磷酸盐缓冲液， 水相与有机相的初始体积比为5545， 洗脱至主峰出来后， 逐渐增大有机相比例， 至水相与有机相的体积比达到2575。权利要求书1/1 页2CN 106706768 A2一种分离测定恩格列净及其有关物质的方法技术领域0001本发明属于药物分析方法领域， 具体涉及一种采用高效液相色谱法分离测定降糖药恩格列净及其有关物质的方法。背景技术0002恩格列净为一种选择性钠-葡萄糖协同转运蛋白(SGLT)抑制剂， 用于治疗成人II型糖尿病。 恩格列净通过对钠-葡萄糖协同转运蛋白选择性抑制作用， 限制了大部分葡萄糖在体内的重吸收， 促使葡糖大量从尿中排出达到控制血糖水平的目的。0003恩格列净的化学结构式如下：其化学名为： (1S)-1,5-脱水-1-C-4-氯-3-4-(3S)-四氢-3-呋喃基氧基苯基甲基苯基-D-葡萄糖醇。0004恩格列净为全合成化学药， 反应过程中可能产生的副产物或残留的中间体会影响其纯度和质量； 在其储存过程中， 可能会因为温度、 光照等环境因素导致降解产物产生， 也会影响其纯度和质量。 这些残留的中间体、 副反应产物、 降解产物就是通常药物质量控制中所说的有关物质。0005目前， 有关恩格列净及其组合物的有关物质测定方法未见报道， 为保证恩格列净原料药及其药物组合物的质量可控， 以确保其有效性和安全性， 亟需一种有效的检测方法，能够有效分离测定恩格列净及其有关物质。 本发明人经过大量的科学试验和测试条件的筛选， 发现一种快速分离测定恩格列净及其有关物质的方法， 该方法可以有效控制了恩格列净的工艺杂质和降解产物， 保证了恩格列净原料药及其药物组合物的质量可控， 从而完成了本发明。0006本发明人发现， 已上市的恩格列净片剂， 其中含有的乳糖、 微晶纤维素等药用辅料在本发明的方法中不会干扰测定恩格列净及其有关物质的测定。 因此， 本发明同样适用于恩格列净的药物组合物。发明内容0007本发明的目的在于提供一种分离测定恩格列净及其有关物质的方法， 该方法能将恩格列净与其有关物质有效分离， 准确检测恩格列净原料药和其药物组合物中的有关物质， 从而控制恩格列净的质量， 确保恩格列净药品的有效性和安全性。0008为实现本发明的目的， 提供如下实施方案。0009在实施方案中， 本发明是一种分离测定恩格列净及其有关物质的方法， 该方法包说明书1/11 页3CN 106706768 A3括采用高效液相色谱法， 以辛烷基硅烷键合硅胶填料柱或苯基硅烷键合硅胶填料柱为色谱柱， 以磷酸溶液或磷酸盐缓冲液为水相与以甲醇乙腈组成的有机相混合作为流动相， 进行梯度洗脱， 以紫外检测器进行检测。0010在上述实施方案中， 本发明的方法， 所述磷酸溶液或磷酸盐缓冲液的pH值为26，优选为3.5， 其中， 所述磷酸盐缓冲液所用磷酸盐选自磷酸二氢钠、 磷酸二氢钾和磷酸二氢铵， 优选磷酸盐为磷酸二氢钠， 用磷酸溶液调节pH值， 水相中磷酸盐浓度为00.005mol/L，优选0.002mol/L。0011在上述实施方案中， 本发明的方法， 所述有机相为甲醇与乙腈的混合溶液， 其中，甲醇-乙腈的体积比为50:50。0012在上述实施方案中， 本发明的方法， 水相与有机相的洗脱初始体积比为65354555， 优选5545， 水相与有机相的洗脱终止体积比为35651585， 优选2575。0013在上述实施方案中， 本发明的方法， 紫外检测波长为200250nm， 优选为224nm。0014在上述实施方案中， 本发明的方法， 进一步包括以下步骤：（1） 取恩格列净原料药或其药物组合物， 加流动相使恩格列净完全溶解并稀释定容， 配制成每1ml溶液中含恩格列净0.40.8mg， 优选0.8mg,滤过， 作为供试品溶液；（2） 以辛烷基硅烷键合硅胶填料柱或苯基硅烷键合硅胶填料柱为色谱柱， 流速为0.81.2ml/min， 优选1.0ml/min， 柱温为2030， 优选25， 波长为200250nm， 优选为224nm；（3） 取供试品溶液1030 l， 优选20 l， 注入高效液相色谱仪；（4） 将水相pH26的磷酸溶液或磷酸盐缓冲液与有机相甲醇、 乙腈以65354555为初始体积比洗脱至主峰出来后， 逐渐增大有机相比例， 至水相与有机相的体积比达到35651585并保持不少于10分钟， 完成恩格列净有关物质的测定；（5） 采用不加校正因子的主成分对照品法以峰面积计算恩格列净的纯度及有关物质中各单一杂质含量及有关物质总量。0015在上述实施方案中， 本发明的方法， 步骤 （4） 中优选的水相为pH3.5的磷酸溶液； 优选的水相与有机相初始体积比为5545， 洗脱至主峰出来后， 逐渐增大有机相比例， 优选的水相与有机相最终体积比达到2575并保持10分钟， 完成恩格列净有关物质的测定。0016在上述实施方案中， 本发明的方法， 所述梯度洗脱包括： 0min至第1824min时， 流动相中水相与有机相的体积比为60405050； 第1824min至第4854min时， 水相与有机相的体积比匀速变化至30701585； 第4854min至第5864min时水相与有机相的体积比保持比例不变。0017在上述实施方案中， 本发明的方法， 优选的梯度洗脱包括： 0min至第19.5min时， 流动相中水相与有机相的体积比为5545； 第19.5min至第50min时， 水相与有机相的体积比匀速变化到2575； 第50min至第60min时水相与有机相的体积保持比例2575不变。0018在一具体实施方案中， 本发明所说的用高效液相色谱分离测定恩格列净及其有关物质的方法， 包括以下步骤：（1） 取恩格列净原料药或制剂， 精密称定， 加流动相适量使恩格列净溶解， 再用流动相稀释制成每1ml中含恩格列净0.40.8mg的溶液， 必要时滤过， 作为供试品溶液； 另精密称取恩格列净对照品适量， 用流动相溶解并稀释制成每1ml中含0.61.2 g的溶液， 作为对照说明书2/11 页4CN 106706768 A4品溶液；（2） 取供试品溶液和对照品溶液各1030 l， 注入高效液相色谱仪， 进行梯度洗脱， 色谱条件如下： 选择以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂或苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱， 以磷酸溶液(取纯化水， 用磷酸调pH值至26)或磷酸盐缓冲液(如0.002mol/L磷酸二氢钠溶液， 用磷酸调pH值至26)作为流动相水相,以甲醇和乙腈混合溶液作为流动相有机相， 进行梯度洗脱， 柱温为： 2030； 流速为0.81.2ml/min检测波长为200250nm， 梯度洗脱条件如下： 0min至第1824min时， 流动相中水相与有机相的体积比为60405050；第1824min至第4854min时， 水相与有机相的体积比匀速变化至30702080； 第4854min至第5864min时水相与有机相的体积比保持比例不变， 此时已完成有关物质测定，记录色谱图；（3） 为了连续进样， 可以设置一段平衡色谱系统的过程， 即第5864min至第58.564.5min时,水相与有机相的体积比匀速变化至初始比例， 再保持10min完成平衡。0019上述本发明所说的用高效液相色谱分离测定恩格列净及其有关物质的方法， 优选的， 包括以下步骤：（1） 取恩格列净原料药或制剂， 精密称定， 加流动相适量使溶解， 再用流动相稀释制成每1ml中含恩格列净0.8mg的溶液， 必要时滤过， 作为供试品溶液； 另精密称取恩格列净对照品适量， 用流动相溶解并稀释制成每1ml中含1.2 g的溶液， 作为对照品溶液。0020（2） 以辛烷基硅烷键合硅胶填充柱 （ZORBAXRx-C8， 4.6250mm， 5m） 或者苯基硅烷键合硅胶填充柱 （Generall-MPH， 4.6250mm， 5m） 为色谱柱； 以磷酸溶液(取纯化水， 用磷酸调pH值至3.5)作为流动相的水相， 以甲醇-乙腈 （50:50） 作为流动相的有机相， 进行梯度洗脱； 柱温为25； 流速为1.0ml/min检测波长为224nm， 梯度洗脱条件如下： 0min至第