【发明专利】一种编辑CYP4F8基因的系统及其用途 CN114574487A.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011392234.7(22)申请日 2020.12.02(71)申请人 江苏浦珠生物医药科技有限公司地址 210046 江苏省南京市江北新区新锦湖路3-1号中丹生态生命科学产业园一期A栋926-3室(72)发明人 刘启慧黄童赵恩峰王延宾贺小宏任江涛韩露(74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有限公司 32103专利代理师 范晴(51)Int.Cl.C12N 15/113(2010.01)C12N 9/22(2006.01)C12N 5/10(2006.01) (54)发明名称一种编辑CYP4F8基因的系统及其用途(57)摘要本发明涉及CYP4F8基因的编辑， 尤其是筛选到针对CYP4F8的敲除效率较高的sgRNA序列， 其包含的间隔子序列如SEQ ID NO： 14所示。权利要求书1页 说明书5页序列表6页CN 114574487 A2022.06.03CN 114574487 A1.一种靶向CYP4F8的sgRNA， 其包含的间隔子序列如SEQ IDNO： 14所示。2.权利要求1所述的sgRNA， 其包含选自SEQ ID NO： 1-12的骨架序列。3.一种DNA分子， 其编码权利要求1或2所述的sgRNA。4.一种载体， 其包含权利要求3所述的DNA分子。5.一种基因编辑系统， 其包含Cas9酶和权利要求1或2所述的sgRNA序列。6.一种在体外敲除细胞中的CYP4F8基因的方法， 包括将该细胞与Cas9酶和权利要求1或2所述的sgRNA接触。7.权利要求6所述的方法， 其中所述Cas9酶是蛋白或编码核酸的形式， 所述sgRNA是RNA分子、 其编码核酸或载体的形式。8.权利要求6所述的方法， 所述细胞是293T细胞、 T细胞、 B细胞、 巨噬细胞、 树突状细胞、单核细胞、 NK细胞和/或NKT细胞。9.权利要求8所述的方法， 所述T细胞是CD4+CD8+T细胞、 CD4+T细胞、 CD8+T细胞、 记忆T细胞、 幼稚T细胞、 -T细胞或 -T细胞。权利要求书1/1 页2CN 114574487 A2一种编辑CYP4F8基因的系统及其用途技术领域0001本发明属于基因工程和基因遗传修饰技术领域， 涉及基于CRISPR/Cas9技术的CYP4F8基因的编辑及其用途。背景技术0002CYP4F8是一种细胞色素P450单加氧酶， 其可以将COX产物氧化并羟基化为19-羟基-PGE2。 PGE2可以刺激各种前列腺受体亚型， 而19-羟基-PGE2则对EP2受体亚型表现出选择性。 在前列腺癌中， EP2受体与PGE2的结合可以诱导血管内皮生长因子(VEGF)的分泌、 细胞运动、 生长和血管生成。 有研究表明， 即使部分敲低CYP4F8的表达也会显著降低前列腺癌细胞的细胞活力。 因此， CYP4F8的前列腺特异性的表达谱以及19-羟基-PGE2对EP2受体的激活表明， 抑制CYP4F8可能是一种有吸引力的治疗前列腺癌的方法。发明内容0003目前， CRISPR技术作为一种新的基因组工程化工具， 由于其操作简单， 靶向精确，已被广泛应用于细胞的基因组编辑和免疫疗法的开发中。 最常用的包括II型、 V型、 VI型等CRISPR系统。 以II型CRISPR系统为例， 在外源DNA入侵时， 来自CRISPR重复阵列的转录物被Cas9和RNase III核酸酶加工为成熟的crRNA， 随后与tracrRNA和Cas9组成复合体。 通过识别PAM， crRNA将该复合体引导至靶标DNA， 并通过crRNA包含的间隔区序列与靶DNA的结合，解开DNA双链， 再由Cas9中的HNH结构域剪切crRNA的互补DNA链， RuvC结构域剪切非互补链，最终在靶标DNA处引入双链断裂。 人们还发现， 引导Cas9结合并切割特定的DNA序列不需要RNA复合物。 通过使用设计的嵌合单向导RNA(sgRNA)可以简单地实现该过程。0004术语 “单向导RNA” 或 “sgRNA” 是指通过将crRNA和tracrRNA分子融合成 “单个向导RNA” 的人工工程化RNA， 当与Cas9蛋白结合时， 其能够识别并切割向导RNA特异性的DNA靶标。 sgRNA一般包含间隔子序列(spacer)和骨架序列， 这两个序列可以在同一个分子中或不同的分子中。 间隔子序列的作用是指导Cas9蛋白切割与间隔子序列互补的DNA位点， 也即靶序列。 一般而言， 间隔子序列是与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交、 并且指导CRISPR复合物与该靶序列特异性结合的任何多核苷酸序列。 间隔子序列与其相应的靶序列之间的互补程度是约或多于约50或更多。 一般间隔子序列的长度为约20个核苷酸。 骨架序列为sgRNA中必须的， 除间隔子序列之外的其余序列， 一般包含tracr序列和tracr配对序列， 这些序列一般不会因为靶序列的变化而改变。 由于骨架序列不影响sgRNA对靶序列的识别， 因此， 骨架序列可以是现有技术中任何可行的序列。 骨架序列的结构可参见如文献Nowak et al.Nucleic AcidsResearch 2016.44:9555-9564。0005在本文中可采用的骨架序列如下表1所示。0006表1.示例性的sgRNA骨架序列说明书1/5 页3CN 114574487 A300070008sgRNA， 尤其是其中间隔子序列的设计需要考虑很多因素， 例如长度、 碱基组成、 靶基因的结合位置、 与非靶标位点的结合率、 是否包含SNP、 二级结构等等。 目前已经可以通过各种在线工具来设计sgRNA。 然而， 由于Cas酶可以切割任何邻近PAM位点的靶序列， 针对特定的靶基因而言， 在线工具设计的大量sgRNA的编辑效率都不尽相同， 甚至差异很大， 例如，PAM位点是5-NGG-3的编辑效率通常就比5-NGA-3或5-NAG-3的高。 因此， 筛选特异性高的sgRNA对于CRISPR系统编辑效率的提高至关重要。0009因此， 在第一个方面， 本发明提供一种靶向CYP4F8的sgRNA， 其包含的间隔子序列如SEQ ID NO： 14所示。0010在一个优选的实施方案中， 所述sgRNA还包含选自SEQ ID NO： 1-12的骨架序列。0011在第二个方面， 本发明还提供表达本发明所述的sgRNA的DNA分子以及包含所述DNA分子的载体。0012在第三个方面， 本发明还提供一种基因编辑系统， 其包含Cas9酶和本发明所述的sgRNA序列。0013在第四个方面， 本发明提供了一种在体外敲除细胞中的CYP4F8基因的方法， 包括将该细胞与Cas9酶和sgRNA接触， 其中所述sgRNA包含如SEQ ID NO： 14所示的间隔子序列。说明书2/5 页4CN 114574487 A40014在一个实施方案中， 所述Cas9酶是蛋白或编码核酸的形式， 所述sgRNA是RNA分子、其编码核酸或载体的形式。 例如， 可以将细胞与Cas9蛋白和sgRNA直接接触， 或者将细胞与Cas9蛋白的编码核酸和sgRNA接触， 或者将细胞与Cas9蛋白和sgRNA的编码核酸直接接触。0015在一个实施方案中， 所述细胞是免疫细胞， 例如293T细胞、 T细胞、 B细胞、 巨噬细胞、 树突状细胞、 单核细胞、 NK细胞和/或NKT细胞等。 优选地， 所述免疫细胞是T细胞、 NK细胞或NKT细胞， 所述T细胞优选CD4+CD8+T细胞、 CD4+T细胞、 CD8+T细胞、 记忆T细胞、 幼稚T细胞、 -T细胞、 -T细胞。0016下面将结合实例来详细说明本发明。 需要说明的是， 本领域的技术人员应该理解本发明的实施例仅仅是为了例举的目的， 并不能对本发明构成任何限制。 在不矛盾的情况下， 本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。具体实施方式0017实施例1.sgRNA载体构建0018使用CRISPR在线设计工具(http:/crispr.mit.edu/)， 根据评分系统， 分别针对CYP4F8的1号外显子、 2号外显子、 4号外显子、 6号外显子设计sgRNA间隔子序列， 并根据sgRNA间隔子序列设计相应的寡核苷酸链， 其序列分别如下表2和表3所示。0019表2.sgRNA的间隔子序列002000210022表3.sgRNA间隔子序列的寡核苷酸序列0023名称寡核苷酸序列sgRNA-1oligo15 -caccgAAGAACCAGTTCTGTTTCCG-3 (SEQ ID NO： 17)sgRNA-1oligo25 -aaacCGGAAACAGAACTGGTTCTTc-3 (SEQ ID NO： 18)sgRNA-2oligo15 -caccgATGACAGATCGGACGATGTC-3 (SEQ ID NO： 19)sgRNA-2oligo25 -aaacGACATCGTCCGATCTGTCATc-3 (SEQ ID NO： 20)sgRNA-3oligo15 -caccgAGGCAGGCGTCAGCAAGCGA-3 (SEQ ID NO： 21)sgRNA-3oligo25 -aaacTCGCTTGCTGACGCCTGCCTc-3 (SEQ ID NO： 22)sgRNA-4oligo15 -caccgCATGGCCAGGCGTTGCCACT-3 (SEQ ID NO： 23)sgRNA-4oligo25 -aaacAGTGGCAACGCCTGGCCATGc-3 (SEQ ID NO： 24)0024将1 g LentiCRISPR V2质粒(Addgene， 52961， 其包含Cas9编码序列和sgRNA骨架序列的编码序列)用BsmbI酶于37酶切30分钟， 并用天根胶回收试剂盒(天根， DP209-02)纯化酶切质粒产物。 将一对sgRNA oligo退火形成双链， 并与酶切的LentiCRISPR V2质粒进说明书3/5 页5CN 114574487 A5行连接， 16孵育2h。 然后， 将连接质粒转化至感受态细胞DH5 ， 均匀涂至amp抗性LB固体培养基平板中， 置于37培养箱中培养12-16小时， 然后挑取单个菌落扩大培养并提取质粒，通过测序确定sgRNA序列被正确克隆入LentiCRISPR V2质粒。0025实施例2.细胞转染并检测敲除效率0026使用脂质体转染法将携带sgRNA序列的LentiCRISPR V2质粒转染入293T细胞。 具体地， 提前用完全培养基(10胎牛血清的高糖DMEM培养基)接种293T细胞， 并于5CO2， 37恒温培养箱中培养1天， 待细胞达到70-90汇合度时进行转染。 将转染试剂(125 l Opti-MEM、 3.75 l Lipo3000R)与DNA预混液(125 l Opti-MEM、 5 g LentiCRISPR V2质粒、10 l P3000TM)以1： 1的比例混合， 25孵育5分钟后， 将其加入293T细胞。 将细胞置于37培养培养箱继续培养48-72小时后， 用含1ng/ml嘌呤霉素的完全培养基进行抗性筛选， 并将阳性细胞用完全培养基恢复培养2-3天。 收集细胞， 并用FACs法鉴定基因敲除效率， 结果如下表4所示。0027表4.不同sgRNA的敲除效率0028名称敲除效率sgRNA-160.0sgRNA-283.3sgRNA-330.0sgRNA-424.00029从上表可以看出， sgRNA-1敲除效率约为60， sgRNA-2的敲除效率最高， 达到约85， 远远高于其他3个sgRNA的敲除效率。0030实施例3.基因表达验证0031提取经嘌呤霉素筛选的阳性293T细胞的RNA， 并将其逆转录为cDNA， 然后用以下引物检测细胞中的CYP4F8基因的表达情况， 结果如表5所示。0032P-F： TCTTCGCAATCCATCACAAC(SEQ ID NO： 25)0033P-R： ACCACCT