【发明专利】一种重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用 CN107236046A.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710339825.X(22)申请日 2017.05.15(71)申请人 江苏吴中医药集团有限公司苏州中凯生物制药厂地址 215100 江苏省苏州市吴中经济开发区澄湖路42号申请人 常州南京大学高新技术研究院(72)发明人 徐根兴华子春谷鹏荣志刚朱浩文黄佩华(74)专利代理机构 北京三聚阳光知识产权代理有限公司 11250代理人 李敏(51)Int.Cl.C07K 16/46(2006.01)C12N 15/13(2006.01)C12N 15/62(2006.01)C07K 19/00(2006.01)G01N 33/68(2006.01)G01N 33/574(2006.01)A61K 38/39(2006.01)A61K 47/42(2017.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称一种重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种Her2纳米抗体二聚体与一种重组人内皮抑素构成融合蛋白及其制备方法和应用， 重组人内皮抑素融合蛋白包括Her2纳米抗体二聚体和重组人内皮抑素蛋白， 该融合蛋白易于纯化， 能特异性靶向Her2高表达的乳腺癌细胞， 并具有较好的穿膜效果， 能有效抑制肿瘤细胞生长； 本发明公开了重组人内皮抑素融合蛋白可应用于制备临床上靶向检测或治疗乳腺癌的药物， 可提高药物在肿瘤病变部位的浓度， 相应提高了量效比； 本发明还公开了重组人内皮抑素融合蛋白的编码基因的重组表达载体、 转基因细胞系或转基因重组菌， 以及基因工程制备方法， 以应用于融合蛋白的临床生产制备。权利要求书2页 说明书14页序列表17页 附图9页CN 107236046 A2017.10.10CN 107236046 A1.一种Her2纳米抗体二聚体， 其特征在于， 所述Her2纳米抗体二聚体包括2个Her2纳米抗体单体、 连接肽和Her2结合肽。2.根据权利要求1所述的Her2纳米抗体二聚体， 其特征在于， 所述连接肽序列如SEQ ID NO.4所示， 所述Her2结合肽序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1或2所述的Her2纳米抗体二聚体， 其特征在于， 所述Her2纳米抗体二聚体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.一种编码权利要求1-3任一项所述的Her2纳米抗体二聚体的基因， 其特征在于， 所述Her2纳米抗体二聚体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。5.一种重组人内皮抑素融合蛋白， 其特征在于， 所述重组人内皮抑素融合蛋白包括权利要求1-4任一项所述的Her2纳米抗体二聚体和重组人内皮抑素蛋白。6.根据权利要求5所述的重组人内皮抑素融合蛋白， 其特征在于， 所述重组人内皮抑素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。7.根据权利要求5或6所述的重组人内皮抑素融合蛋白， 其特征在于， 所述Her2纳米抗体二聚体连接于所述重组人内皮抑素蛋白的N端或C端。8.根据权利要求5-7任一项所述的重组人内皮抑素融合蛋白， 其特征在于， 所述重组人内皮抑素融合蛋白还包括连接Her2纳米抗体二聚体和所述重组人内皮抑素蛋白的连接肽，所述连接肽序列如SEQ ID NO.4所示。9.根据权利要求5-8任一项所述的重组人内皮抑素融合蛋白， 其特征在于， 所述重组人内皮抑素融合蛋白选自如下蛋白：(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)， 其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；(N)-重组人内皮抑素蛋白-Her2纳米抗体二聚体-(C)， 其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示； 或(N)-Her2纳米抗体二聚体-连接肽-重组人内皮抑素蛋白-(C)， 其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。10.一种编码权利要求5-9任一项所述的重组人内皮抑素融合蛋白的基因， 其特征在于， 所述编码基因选自如下基因：(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)的编码基因， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；(N)-重组人内皮抑素蛋白-Her2纳米抗体二聚体-(C)的编码基因， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示； 或(N)-Her2纳米抗体二聚体-连接肽-重组人内皮抑素蛋白-(C)的编码基因， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。11.包含权利要求4所述的Her2纳米抗体二聚体的编码基因或权利要求10所述的重组人内皮抑素融合蛋白的编码基因的重组表达载体、 转基因细胞系或转基因重组菌。12.一种重组人内皮抑素融合蛋白的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤：(1)构建权利要求4所述Her2纳米抗体二聚体的编码基因和重组人内皮抑素蛋白的编码基因；(2)将步骤(1)中的编码基因克隆至表达载体中得到重组表达载体；权利要求书1/2 页2CN 107236046 A2(3)将步骤(2)中获得的所述重组表达载体转化宿主细胞， 获得表达重组人内皮抑素融合蛋白的工程菌， 发酵培养得到所述重组人内皮抑素融合蛋白；(4)纯化分离得到的所述重组人内皮抑素融合蛋白。13.权利要求5-9所述的重组人内皮抑素融合蛋白在制备检测或靶向治疗乳腺癌的药物中的应用。权利要求书2/2 页3CN 107236046 A3一种重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用技术领域0001本发明属于医药生物技术领域， 具体涉及一种重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用。背景技术0002肿瘤需要功能性的血管网络提供氧气、 养料并清除代谢产物。 肿瘤除了通过与宿主血管融合而获得部分血管外， 还必须通过形成新生血管网构建自己的血管系统， 这样才能持续地生长和发展。 如果没有血管系统提供氧气和养料， 实体瘤的增长不会超过1mm3。 实体肿瘤的生长和转移依赖于新生血管生成的学说的提出， 为肿瘤治疗开辟了一个新的途径。00031997年， 哈佛大学O Reilly等发现小鼠血管内皮瘤(EOMA)细胞系的培养液能够抑制血管内皮细胞的增殖。 通过分离纯化得到一种新的蛋白质， 命名为鼠的Endostatin， 后来翻译成血管内皮抑制素(简称内皮抑素)。 内皮抑素是由细胞外基质成分胶原X的羧基末端水解而来的一种动物体内天然存在的蛋白， 是一种内源性血管形成抑制因子， 能有效地抑制机体内病理性血管的形成， 具有广谱的抗肿瘤作用。 关于人血管内皮抑制素(ES)， 在临床研究中发现， Down s综合症病人的ES表达水平较高， 实体瘤发病率很低； 癌症患者血清中ES的含量有利于总生存时间的延长。 体外研究发现， ES特异性地抑制微血管内皮细胞的增殖、 迁移、 粘附和存活， 能有效地抑制鸡胚尿囊膜(CAM)新生血管的形成， 而实验性动物研究也证实ES有显著的抗肿瘤作用。 目前发现ES可以和内皮细胞(ECs)表面多个非特异性受体结合， 抑制ECs在血管形成中的作用。 人血管内皮抑制素同样具有抑制肿瘤的作用， 因此， 关于人内皮抑素的研究也越来越多。0004中国专利文献CN1177005A是国际上关于内皮抑素的最早获得授权的专利之一， 其中通过大肠杆菌表达了人内皮抑素基因， 是人胶原蛋白十八基因1503-2055表达的蛋白活性片段， 184个氨基酸， 分子量20KD， 与小鼠内皮抑素氨基酸序列有85.33的同源性， 目前已经完成三期临床研究。 我国以大肠杆菌表达系统生产了新型重组人内皮抑素(recombinant human endostatin， rh-ES， 商品名Endostar， 恩度)， 其氨基末端经过基因修饰加上了9个氨基酸序列(MGGSHHHHH)， 形成6个组氨酸标签， 从而简化了纯化工艺， 中国食品药品监督管理局(SFDA)在2005年9月批准了恩度联合NP(诺维本+顺铂)方案治疗晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma， NSCLC)的适应症。 但是Endostar在使用时仍存在一些缺点， 如由于其体内半衰期短， 入胞能力差， 临床上的使用剂量较大， 增加了患者的经济和身体负担。 为解决上述问题， 中国专利文献CN105646701A中公开了一种与Endostar有13个氨基酸差异的重组内皮抑素蛋白， 该重组内皮抑素蛋白更容易进入血管内皮细胞和鸡胚绒毛尿囊膜血管内皮细胞， 蛋白穿膜效果和N端的结构稳定性都有了显著提高。 虽然改造后的重组内皮抑素其抑制肿瘤细胞生长的效果显著提高， 但重组内皮抑素进入人体后由于不具备器官靶向性， 会在体内随内循环进入各处， 导致其组织分布的相对平均， 未能在病灶部位形成有效的抗肿瘤浓度， 且由于其未能有效地输送至病变部位会产生说明书1/14 页4CN 107236046 A4扩散降解， 因此临床使用剂量较高和使用周期较长。 为了提高重组内皮抑素蛋白的靶向性，目前采用的融合蛋白通常采用人源的单克隆抗体融合到重组内皮抑素蛋白上以提高靶向性， 如美国专利文献US9611313B2中， 将人类野生型人内皮抑制素huEndo或突变形式的人内皮抑制素(huEndo-P125A)融合到人源化抗HER2IgG3抗体的3端， 产生两种抗HER2人内皮抑素融合蛋白 HER2-huEndo和HER2IgG3-huEndo-P125A， 然而采用人源的单克隆抗体虽然能够提高靶向性， 但是申请人发现人源的单克隆抗体穿膜效果较差， 限制了抗HER2人内皮抑素融合蛋白的应用。0005Her2是由原癌基因Her2/neu编码的185KD的跨膜受体， 是表皮生长因子(EGF)酪氨酸蛋白激酶受体家族的成员。 大约26的乳腺癌出现Her2基因的高表达， 其过度活化可能与肿瘤的增殖、 浸润和转移等行为有关， 因此Her2被认为是乳腺癌检测和治疗的最佳靶点，已经有相应的抗体药物如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗等临床使用。 曲妥珠单抗治疗Her2阳性乳腺癌疗效确切， 但即使是Her2高表达或基因扩增的患者， 有效率也仅为1234。 纳米抗体(nanobody,Nb)是近年来发现的一种新型抗体， 即重链单域抗体VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody)， 来源自骆驼体内存在着天然缺失轻链的重链抗体(heavy-chain antibody,HCAb)， 克隆其可变区而得到的只由一个重链可变区组成的单域抗体， 是目前可以得到的具有完整功能的稳定的可结合抗原的最小单位。 其相对分子质量为15KD， 比单抗小很多， 可以有效地穿透浓密的组织， 到达传统抗体无法到达的地方，并且纳米抗体迅速通过肾脏系统的过滤排出身体。 因此， 当纳米抗体用放射性或荧光染料标记， 可以在给药后在靶细胞部位产生非常高的对比度， 对肿瘤的检测和靶向治疗具有非常重要的临床价值。 但纳米抗体单体由于分子量过小， 进入人体后稳定性差， 作为药物使用时需要多次服药以维持药用浓度； 同时纳米抗体在保藏以及运输过程中容易发生降解， 不利于长时间保藏与运输， 使纳米抗体的使用成本升高， 影响了纳米抗体作为疾病治疗药物开发中的药用效果， 因此， 现有技术中还未提出一种利用纳米抗体制备重组人内皮抑素融合蛋白的方案。发明内容0006因此， 本发明要解决的第一个技术问题在于克服现有技术中纳米抗体单体在进入人体后易分解， 保藏时稳定性较低， 易随保藏时间延长而发生降解的缺陷， 从而提供一种可以长时间稳定保藏和运输的Her2纳米抗体二聚体。0007本发明要解决的第二个技术问题在于克服现有技术中的重组人内皮抑素进入人体后由于不具备器官靶向性或靶向性差,未能有效地输送至病变部位产生扩散降解， 从而提供一种可以靶向Her2阳性乳腺癌病变部位， 并能有效抑制乳腺癌细胞增殖的重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用。0008本发明提供了一种Her2纳米抗体二聚体， 所述Her2纳米抗体二聚体包括2个Her2纳米抗体单体、 连接肽和Her2结合肽