【发明专利】一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白及其制法和用途 CN104177500A.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310432137.X(22)申请日 2013.09.22(65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104177500 A(43)申请公布日 2014.12.03(66)本国优先权数据201310201278.0 2013.05.24 CN(73)专利权人 江苏靶标生物医药研究所有限公司地址 213164 江苏省常州市常武中路801号常州科教城科教会堂南楼2204室(72)发明人 华子春邱樊胡敏进(74)专利代理机构 常州佰业腾飞专利代理事务所(普通合伙) 32231代理人 金辉(51)Int.Cl.C07K 19/00(2006.01)C12N 15/62(2006.01)C12N 15/63(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12P 21/02(2006.01)A61K 47/62(2017.01)A61K 38/17(2006.01)A61P 35/00(2006.01)C12R 1/19(2006.01)(56)对比文件CN 1665543 A,2005.09.07,CN 1546528 A,2004.11.17,CN 1609124 A,2005.04.27,Qiu F.等.Annexin V-TRAIL fusion protein is a more sensitive and potent apoptotic inducer for cancer therapy.SCIENTIFIC REPORTS .2013,审查员 马静 (54)发明名称一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白及其制法和用途(57)摘要本发明属生物技术领域， 具体公开了一种肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白融合蛋白及其制法和用途。 该融合蛋白是由膜联蛋白、 连接肽、 肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白组成的， 通过克隆构建该融合蛋白的编码基因。 该肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白融合蛋白具有显著增强的诱导细胞凋亡的效果， 能够使得诱导对细胞凋亡不敏感的肿瘤细胞凋亡， 能够降低获得治疗效果所需要的蛋白给药剂量。权利要求书1页 说明书43页 附图9页CN 104177500 B2018.05.25CN 104177500 B1.一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白， 其特征在于： 所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO： 1中所示， 它包括膜联蛋白V的氨基酸序列、 肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白的氨基酸序列、 以及位于膜联蛋白氨基酸序列和肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白氨基酸序列之间的连接肽序列3部分， 其中所述的肿瘤坏死因子家族细胞凋亡蛋白是指肿瘤坏死因子家族中具有诱导细胞凋亡活性的成员蛋白质。2.一种分离的DNA分子， 其特征在于： 它编码权利要求1所述的融合蛋白。3.根据权利要求2所述的DNA分子， 其特征在于： 其核苷酸序列如SEQ ID NO： 7中所示。4.一种载体， 其特征在于： 它含有权利要求2或3所述的DNA分子。5.一种宿主细胞， 其特征在于： 它含有权利要求4所述的载体。6.根据权利要求5所述的宿主细胞， 其特征在于： 它包括重组大肠埃希菌BL21。7.一种制备权利要求1所述的融合蛋白的方法， 其特征在于， 它包括如下步骤： 在适合表达所述融合蛋白的条件下， 培养权利要求5所述的宿主细胞， 从而表达出所述的融合蛋白； 和分离所述的融合蛋白。8.根据权利要求7所述的制备方法， 其特征在于： 所述宿主细胞在低温下进行培养和诱导表达， 所述低温指10-35。9.根据权利要求8所述的制备方法， 其特征在于： 所述分离融合蛋白采用离子交换层析和金属亲和层析。10.根据权利要求1所述的一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白在制备诱导细胞凋亡的治疗药物中的应用。11.根据权利要求1所述的一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白在制备肿瘤治疗药物中的应用。12.根据权利要求11所述的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白应用在制备肿瘤治疗药物中的应用， 其特征在于： 所述应用包括将所述融合蛋白单独用于制备肿瘤治疗药物， 或与现有的肿瘤治疗药物联合用药， 或与现有的肿瘤治疗药物组成组合物， 或与现有化疗、 放疗、 中药治疗、 生物治疗方法在肿瘤治疗中联合应用。13.一种药物组合物， 其特征在于： 包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂， 以及有效量的权利要求1所述的融合蛋白。权利要求书1/1 页2CN 104177500 B2一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白及其制法和用途技术领域0001本发明属生物技术领域， 涉及一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白及其制法和用途。背景技术0002癌症是世界上导致死亡的第二大因素。 目前治疗癌症的方法除手术外， 主要是化疗和放疗， 但这两种方法缺乏特异性， 具有明显的细胞毒性。 理想的抗肿瘤药物是能选择性地杀死肿瘤细胞而不伤害正常细胞。 许多化疗药物是通过诱导凋亡来杀死肿瘤细胞的， 肿瘤细胞也会通过产生抑制凋亡的机制而导致化疗的失败。 因此， 凋亡通路成为研制抗肿瘤药物的最具吸引力的靶点。0003自从Aggarwal等人1984年分离并鉴定出首个肿瘤坏死因子 （TNF） 至今， 这个蛋白家族已有19名成员。 肿瘤坏死因子家族成员通过与其受体家族-肿瘤坏死因子受体家族相互作用， 发挥重要生理作用。 肿瘤坏死因子及其受体家族系统在自身免疫性疾病、 细菌和病毒感染、 肿瘤、 糖尿病、 骨质疏松等多种疾病的发生与发展中起关键作用。 因此， 大部分肿瘤坏死因子及其受体家族成员被作为多种疾病的药物靶点进行广泛开发。 美国食品药品管理局 （FDA） 已批准5种TNF阻断剂药物上市销售， 主要用于关节炎、 牛皮癣、 克罗恩病等炎症和自身免疫疾病治疗， 其中有三种药物的销售额已跻身于美国 “重磅炸弹” （年销售额过10亿美元） 行列， 成为最成功的生物技术类药物之一。 2010年11月FDA批准肿瘤坏死因子家族成员之一-RANKL的人源化抗体 （Xgeva） 用于防治肿瘤转移相关的骨破坏病症； 近期， FDA又批准另外一种肿瘤坏死因子家族成员BAFF的中和抗体 （Benlysta） 用于系统性红斑狼疮 （SLE）治疗。 另外， 还有多种肿瘤坏死因子及其受体家族成员相关药物正处于不同的临床试验阶段。 肿瘤坏死因子及其受体家族成为药物开发中的明星家族， 相信不久的将来会有更大的发展。 肿瘤坏死因子及其受体家族成员中， 大部分肿瘤坏死因子家族成员均可以表达为型跨膜蛋白， 包括氨基端的胞内区、 跨膜区、 羧基端的胞外区三部分。 肿瘤坏死因子家族成员的胞外区结构比较类似， 都是由多条反向平行的 折叠片层组成典型的 蛋卷结构， 在与受体结合的几个区域， 氨基酸序列比较保守。 大部分跨膜型TNF家族成员胞外区可以被特定的酶水解产生可溶性蛋白； 可溶性与膜结合型TNF家族成员与受体结合能力相似， 但是可以激活不同的信号途径， 介导不同的生理与病理作用。0004到目前为止， 大约有19种肿瘤坏死因子超家族的成员被克隆出来， 有部分已经作为药物使用如TNF ， TNF ， 大部分还处于临床阶段， 如FasL、 TRAIL、 TWEAK、 RANKL等。 其中， 大部分肿瘤坏死因子家族成员 （例如， FasL、 TNF、 TRAIL等） 都是通过诱导细胞凋亡发挥其生物学及其治疗功能。 以下仅以肿瘤坏死因子相关凋亡配体为例， 说明肿瘤坏死因子家族成员诱导细胞凋亡的作用、 应用及其面临的问题。0005肿瘤坏死因子相关凋亡配体 （TRAIL） 是肿瘤坏死因子 （TNF） 超家族的又一成员， 自从1995年被发现以来， 因为其能诱导一系列的肿瘤细胞凋亡而不影响正常细胞而成为具有重要应用前景的抗肿瘤生物药物 （Walczak.H等， 1999， Nat.Med5:157-163） 。 TRAIL是分子量说明书1/43 页3CN 104177500 B3为30KD的型跨膜蛋白， 能被半胱氨酸蛋白酶加工成分子量为20KD的可溶性蛋白（S.M.Mariani等， 1998， Eur.J.Immonol28:973-982） 。 TRAIL的N端区域是不保守的， 但C端与该家族的其它成员有高度的保守性。 TRAIL是该家族唯一含有半胱氨酸Cys230的蛋白， 该Cys230使三个TRAIL分子能相互作用。 与该Cys结合的锌离子对维持三聚体结构、 可溶性以及正常的生物学功能具有重要的作用 （Mongkolsapaya J等， Nat Struct Biol6:1048-1053） 。 本发明中所称的TRAIL是指可溶性的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体， 通常是指、 但不局限于肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体114-281氨基酸序列， 其中包括了由肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体衍生物 （截短的、 加长的、 突变的突变体蛋白质） 。 TNF超家族的成员FasL以及TNF 的表达是严格控制的、 并且只短暂表达于一些活化的细胞中； 但TRAIL在多种正常组织包括淋巴细胞， 脾， 胸腺， 前列腺， 卵巢以及肠等组织中组成型表达 （在脑和肝脏中不表达） （Wiley,S.R.等， 1995， Immunity3:673-682） 。 在体内， 系统给药时， FasL以及TNF 除了能诱导肿瘤细胞凋亡外还能引起炎症反应以及肝毒性， 但TRAIL不会 （Ashkenazi,A.等，1998， Science281： 1305-1308） 。 因此， TRAIL是一种有前景的抗肿瘤药物。0006凋亡主要由两条通路引起， 即胞外信号通路和胞内信号通路， 但这两条通路最终激活相同的凋亡效应半胱氨酸蛋白酶 （Caspase） 和凋亡效应分子。 胞内凋亡信号通路是由严重的DNA损伤、 缺氧以及其它压力引起的 （如化疗和放疗） 。 胞内信号通路很大程度上是由Bcl-2蛋白家族的凋亡与抗凋亡成员相互作用来介导和调控的 （Wei ,M .C .等， 2001，Science292:727730） 。 胞外凋亡信号通路是由TNF超家族配体结合到相应的受体上引起的。 TRAIL主要是通过胞外通路来诱导凋亡的 （Scaffidi C.等， 1998， EMBO J.17： 16751687） 。 与TNF超家族其它成员不同， TRAIL能与一系列受体结合， 与不同受体结合的亲和力不同， 引起的结果也不同。 TRAIL-R1 （DR4） 和TRAIL-R2 （DR5） 是凋亡受体， 能将TRAIL诱导的凋亡信号传到细胞内 （LeBlanc,H.N.等， 2004， Cell Death Differ10： 6675） 。 TRAIL-R3（DcR1） 和TRAIL-R4 （DcR2） 是假受体， 可拮抗TRAIL的凋亡信号。 TRAIL-R3没有胞内区域而TRAIL-R4的死亡结构域是剪切了的， 因此它们都不能传导凋亡信号。 此外， TRAIL还能与OPG结合， 但亲和力较低。0007如同其它TNF超家族配体成员一样， 肿瘤坏死因子相关凋亡配体诱导凋亡的第一步是三聚体的TRAIL与TRAIL-R1和TRAIL-R2的结合。 TRAIL与其受体的相互作用促使受体成簇并招募接头蛋白FADD， FADD通过死亡效应区域进一步招募Casapase8前体， 进而形成死亡信号诱导复合物 （DISC） （Kischkel FC等， 2000， Immunity12:61120） 。 Casapase8前体招募到DISC后， 通过构象变化以及自我剪切而激活， 激活后的Caspase8进一步剪切和活化效应Caspase3,6,7从而执行细胞凋亡。 根据是否需要胞内信号通路来执行凋亡可将细胞分为两种类型即 型和型。 在 型细胞中， DISC完全活化Caspase8并通过直接活化Caspase3,6,7而诱导凋亡 （Gonzalvez F.等， 2010， Oncogene29:47524765） 。