【发明专利】一种重组的OmpK多表位多肽、构建方法及其应用 CN108530522A.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810208626.X(22)申请日 2018.03.14(71)申请人 中华人民共和国汕头出入境检验检疫局地址 515041 广东省汕头市龙湖区金砂东路126号(72)发明人 张玉晴许如苏汪天杰张峥嵘吴松浩许晓升沈烨周铮宇(74)专利代理机构 深圳国新南方知识产权代理有限公司 44374代理人 黄建才(51)Int.Cl.C07K 14/28(2006.01)C12N 15/85(2006.01)C12N 5/10(2006.01)C12N 15/31(2006.01)A61K 39/106(2006.01)A61P 31/04(2006.01) (54)发明名称一种重组的OmpK多表位多肽、 构建方法及其应用(57)摘要本发明涉及生物医药领域， 具体而言， 本发明涉及重组多肽、 构建方法及其应用， 更具体地，本发明提供了一种重组的OmpK多表位多肽及其编码的核苷酸、 载体、 细胞、 疫苗以及其在预防弧菌感染的产品中的用途。 实验证明， 本发明提供的重组的OmpK多表位多肽或其衍生物及疫苗， 具有安全高效的特点， 其对副溶血性弧菌具很高的免疫原性， 经此多表位多肽免疫的动物， 体内含有大量特异性的抗体， 对免疫的动物有效保护率达到90以上； 而且， 该重组的OmpK多表位多肽提高了接受此多表位多肽免疫的动物对副溶血性弧菌的抵抗能力， 具有良好的免疫保护效应，这在预防控制水产动物传染病的方面具有重要的意义。权利要求书2页 说明书15页序列表7页 附图5页CN 108530522 A2018.09.14CN 108530522 A1.一种重组的OmpK多表位多肽或其衍生物， 其特征在于， 所述多肽或其衍生物选自：1)包含SEQ ID NO： 8-SEQ ID NO： 13所示的氨基酸片段序列；2)包含的氨基酸片段序列分别与1)中氨基酸片段相比具有至少一个或几个氨基酸的取代、 缺失和/或添加， 所述多肽具有对弧菌的免疫原性；3)包含的氨基酸片段序列分别来自副溶血性弧菌， 并且分别与SEQ ID NO： 8-SEQ ID NO： 13具有至少75、 至少80、 至少85、 至少90、 至少95、 至少99的同一性；4)多肽的衍生物， 其为1)-3)任一所述的多肽的衍生物， 所述多肽的衍生物具有对弧菌的免疫原性。2.根据权利要求1所述的多肽或其衍生物， 其特征在于， 还包含接头序列1， 所述接头序列1位于氨基酸片段序列之间；优选的， 所述接头序列1为SEQ ID NO： 14所示的序列；优选的， 所述的氨基酸片段序列按照SEQ ID NO： 8-SEQ ID NO： 13顺序依次连接；优选的， 所述的多肽为SEQ ID NO： 15所示的序列。3.一种重组的OmpK核苷酸， 其特征在于， 所述的核苷酸用来编码权利要求1-2任一权利要求所述的多肽或其衍生物；优选的， 编码SEQ ID NO： 8-SEQ ID NO： 13所示的氨基酸片段序列的核苷酸片段分别为SEQ ID NO： 1-SEQ ID NO： 6所示的核苷酸序列， 还包含接头序列2， 所述接头序列2位于核苷酸序列之间；优选的， 所述的接头序列2为SEQ ID NO： 7所示的核苷酸序列编码；优选的， 所述的核苷酸片段按照SEQ ID NO： 1-SEQ ID NO： 7-SEQ ID NO： 2-SEQ ID NO：7-SEQ ID NO： 3-SEQ ID NO： 7-SEQ ID NO： 4-SEQ ID NO： 7-SEQ ID NO： 5-SEQ ID NO： 7-SEQ ID NO： 6所示的顺序依次连接。4.根据权利要求3所述的核苷酸， 其特征在于， 所述的核苷酸5 端进一步包含起始密码子序列；优选的， 所述的起始密码子序列为ATG；优选的， 所述的起始密码子序列的5 端进一步包含酶切序列；优选的， 所述的起始密码子序列的5 端的酶切序列为BamH 酶切识别序列；优选的， 所述的终止密码子序列的3 端进一步包含酶切序列；优选的， 所述的终止密码子序列的3 端的酶切序列为Hind酶切识别序列；优选的， 所述的核苷酸还包含保护性核苷酸序列；优选的， 所述的保护性核苷酸序列为CGC和GGG；优选的， 所述的核苷酸的序列为SEQ ID NO： 16所示的序列。5.一种载体， 其特征在于， 所述载体包含权利要求3-4任一权利要求所述的核苷酸；优选的， 所述的载体为pET-32a-SEQ ID NO： 16。6.一种细胞， 其特征在于， 所述细胞含有权利要求5所述的载体；优选的， 所述的细胞为pET-32a-SEQ ID NO： 16/E.coli Rosetta细胞。7.一种疫苗， 其特征在于， 所述疫苗包含权利要求1-2任一权利要求所述的表位多肽或其衍生物；优选的， 所述的疫苗还包含佐剂。权利要求书1/2 页2CN 108530522 A28.一种试剂盒， 所述试剂盒包含权利要求1-2任一权利要求所述的多肽或其衍生物、 权利要求5所述的载体、 权利要求6所述的细胞， 和/或权利要求7所述的疫苗。9.权利要求1-2任一权利要求所述的多肽或其衍生物、 权利要求3-4所述的核苷酸、 权利要求5所述的载体、 权利要求6所述的细胞， 和/或权利要求7所述的疫苗在制备预防或治疗弧菌感染的产品中的应用；优选的， 所述的弧菌为副溶血性弧菌。10.一种构建重组的OmpK多表位多肽或其衍生物的方法， 其特征在于， 所述的方法包含如下步骤：(1)利用软件分析OmpK蛋白的序列结构特点， 选出OmpK蛋白的B细胞的线性表位；(2)根据线性表位， 设计相应的核苷酸片段及其排列顺序， 并设计片段连接接头、 酶切位点、 保护性核苷酸、 起始密码子、 终止密码子的位置关系及具体序列；(3)获得(2)中设计的核苷酸序列；(4)获得(3)中核苷酸序列编码的多肽；优选的， 所述步骤(4)中的多肽通过以下步骤获得： a.将步骤(3)获得的核苷酸与表达载体连接； b.转化载体， 获得表达的多肽；优选的， 所述步骤(3)的核苷酸序列为权利要求4所示的核苷酸序列；优选的， 所述步骤(3)的核苷酸序列为SEQ ID NO:16所示的序列；优选的， 所述步骤(4)的多肽序列为权利要求1-2任一权利要求所述的多肽；优选的， 所述步骤(4)的多肽序列为SEQ ID NO:15所示的序列；优选的， 所述的表达载体为pET-32a(+)；优选的， 所述软件为DNAstar protean软件， 用来综合分析OmpK蛋白的二级结构、 柔性、表面可能性、 亲水性和抗原指数。权利要求书2/2 页3CN 108530522 A3一种重组的OmpK多表位多肽、 构建方法及其应用技术领域0001本发明涉及生物医药领域， 具体而言， 本发明涉及重组多肽、 构建方法及其应用，更具 体地， 本发明涉及重组多肽及其编码的核苷酸、 载体、 细胞、 疫苗在预防弧菌感染的产品中 的用途。背景技术0002副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus， VP)是弧菌科弧菌属的一种革兰氏阴性菌， 俗称 嗜盐菌， 副溶血性弧菌， 广泛存在于海洋环境及江河口中， 能够感染鱼、 虾和贝类等多种水 产动物， 引起虾红体病、 鱼类皮肤溃疡等疾病， 是威胁海水养殖产业的主要病原菌之一， 给 水产养殖业带来了巨大的经济损失。 该菌侵染48种海水鱼类之多， 发病率高，流行范围广， 危害严重， 是限制我国海洋鱼类贝类等海洋经济动物养殖业发展的最主要因素之一。 副溶血 性弧菌还是一种重要的食源性致病菌， 是我国沿海地区食物中毒中最常见的一种病原菌， 对 人类健康构成了很大的威胁。 据我国食源性疾病监测网数据， 在我国部分沿海地区微生物食 物中毒事例中， 副溶血性弧菌引发的食物中毒案例占第一位， 也是许多亚洲国家海产品引发 的疾病的主要诱因。0003长期以来， 控制水产动物细菌病的主要手段是使用抗菌药物， 但是随着抗菌药物的反复 使用， 细菌产生耐药性， 抗菌疗效不明显， 导致患病动物大批死亡。0004接种疫苗是预防鱼类传染病的重要方法之一， 国内鱼类疫苗的研究起步较晚， 大多数疫 苗的研发主要还停留在实验室研究阶段， 且多为全菌灭活疫苗。 尽管灭活疫苗非常安全， 但 存在免疫效果较差， 副作用较大的缺点。0005因此， 构建高效、 安全的预防鱼类传染病的疫苗对于预防鱼类传染病具有重要的意义。发明内容0006副溶血性弧菌中存在一种相对保守的重要外膜蛋白(outer membrane protein，omp)K， 该蛋白是弧菌属种类特有的一种外膜蛋白， 1995年， Inoue T首次在副溶血性弧菌中发现并命 名， 该蛋白广泛存在于不同血清型的副溶血性弧菌中， 并在多种弧菌中均存在， 在弧菌中具 有免疫交叉反应性， 且这种免疫交叉反应具有种属特异性。 OmpK蛋白不仅是弧菌中共有的 一种外膜蛋白， 并且OmpK基因在弧菌中高度保守。 2006年杨智慧等从基因水平上证实了 OmpK广泛存在于海水鱼类致病性弧菌中， 是一种免疫原性较好的共同抗原。2007年， 毛志 娟用重组的副溶血性弧菌ompK免疫大黄鱼获得了理想的免疫保护效果， 揭示在自然免疫中 ompK是副溶血性弧菌的重要保护性抗原。 本发明要解决的技术问题是提供了一种重组的OmpK多表位多肽或其衍生物、 重组的OmpK核苷酸、 含有重组的OmpK核苷酸在载体和细 胞、 试剂盒， 及其应用以及构建重组的OmpK多表位多肽或其衍生物的方法。0007本发明第一方面提供了一种重组的OmpK多表位多肽或其衍生物， 所述多肽或其衍生 物选自：说明书1/15 页4CN 108530522 A400081)包含SEQ ID NO： 8-SEQ ID NO： 13所示的氨基酸片段序列；00092)包含的氨基酸片段序列分别与(1)中氨基酸片段相比具有至少一个或几个氨基酸的取 代、 缺失和/或添加， 所述多肽具有对弧菌的免疫原性；00103)包含的氨基酸片段序列分别来自副溶血性弧菌， 并且分别与SEQ ID NO： 8-SEQ ID NO： 13具有至少75、 至少80、 至少85、 至少90、 至少95、 至少99的同 一性；00114)多肽的衍生物， 其为(1)-(3)任一所述的多肽的衍生物， 所述多肽衍生物具有对弧菌的免 疫原性。0012本发明涉及多肽的衍生物。 例如， 本发明的多肽可以含有修饰， 诸如糖基化、 侧链氧化 或磷酸化修饰； 只要所述修饰不影响所述的肽的生物学活性， 即具有B细胞表位识别活性(免 疫原性)。 所述多肽的衍生物的实例还包括带有放射性标记、 生物素标记或荧光标记的多肽。 此外， 本发明还涵盖所述多肽的水合物、 溶剂化物、 或生理学上可接受的盐。0013在一优选例中， 所述的多肽或其衍生物还包含接头序列1， 所述接头序列位于氨基酸片 段序列之间。0014在一优选例中， 所述接头序列1为SEQ ID NO： 14所示的序列。0015在一优选例中， 所述的氨基酸片段序列按照SEQ ID NO： 8-SEQ ID NO： 13顺序依次 连接。0016在一优选例中， 所述的多肽为SEQ ID NO： 15所示的序列。0017本发明第二方面提供了一种重组的OmpK核苷酸， 所述的核苷酸包含编码上面所述的多 肽或其衍生物。0018在一优选例中， 编码SEQ ID NO： 8SEQ ID NO： 13所示的氨基酸片段序列的核苷 酸片段分别为SEQ ID NO： 1-SEQ ID NO： 6所示的核苷酸序列， 还包含接头序列2， 所 述接头序列2位于核苷酸序列之间； 。0019在一优选例中， 所述的接头序列2为SEQ ID NO： 7所示的核苷酸序列编码。0020在一优选例中， 所述的核苷酸片段按照SEQ ID NO： 1-SEQ ID NO： 7-SEQ ID NO：2-SEQ ID N