【发明专利】透明质酸DOTAP生存素编码基因自组装的三元复合物制剂及其制备方法 CN109125741A.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201810914532.4(22)申请日 2018.08.13(65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 109125741 A(43)申请公布日 2019.01.04(73)专利权人 四川大学地址 610065 四川省成都市武侯区一环路南一段24号(72)发明人 魏霞蔚魏于全(74)专利代理机构 成都虹桥专利事务所(普通合伙) 51124代理人 梁鑫(51)Int.Cl.A61K 48/00(2006.01)A61K 9/14(2006.01)A61K 47/36(2006.01)A61K 47/18(2006.01)A61K 47/24(2006.01)A61P 35/00(2006.01)(56)对比文件CN 105125522 A,2015.12.09CN 105873941 A,2016.08.17CN 101361712 A,2009.02.11CN 103045634 A,2013.04.17CN 101417134 A,2009.04.29WO 2009104896 A2,2009.08.27KR 100861278 B1,2008.10.01彭星辰等.Survivin T34A对乳腺癌细胞株4T1增殖和凋亡的影响. 山东医药 .2010,第50卷(第35期),第31-32页.Xie, Fang等.Hepatic Carcinoma Selective Nucleic Acid Nanovector Assembled by Endogenous Molecules Based on Modular Strategy. MOLECULAR PHARMACEUTICS .2016,第14卷(第6期),第1841-1851页.Xu, L.-H.等.Mus musculus baculoviral IAP repeat-containing 5 transcript variant 1 （Birc5） mRNA， complete cds，alternatively spliced. Genbank Database.2008,EU366955.1.审查员 刘波 (54)发明名称透明质酸/DOTAP/生存素编码基因自组装的三元复合物制剂及其制备方法(57)摘要本发明涉及透明质酸/DOTAP/生存素编码基因自组装的三元复合物制剂及其制备方法， 属于医药领域。 本发明所要解决的是现有用透明质酸修饰脂质体的方法操作复杂、 容易产生化学残留、 安全性低、 活性不理想的问题， 其技术方案是提供了透明质酸/DOTAP/生存素编码基因自组装的三元复合物制剂， 包含如下重量份数的原料制备而成： 透明质酸0.11份、 脂质体510份、 装载有生存素编码基因的重组表达载体1份， 其中，所述脂质体包含如下重量配比的组分： DOTAPDOPE1 (0.51)。 本发明通过自组装的方式制备三元复合物制剂， 无需采用化学偶联的方法，操作非常方便。权利要求书2页 说明书9页序列表2页 附图7页CN 109125741 B2022.02.11CN 109125741 B1.一种三元复合物制剂， 其特征是： 由如下重量份数的原料制备而成： 透明质酸0.11份、 脂质体510份、 装载有生存素编码基因的重组表达载体1份， 其中， 所述脂质体由如下重量配比的组分组成： DOTAP DOPE=1 0.51； 所述装载有生存素编码基因的重组表达载体为pVAX质粒载体。2.如权利要求1所述的三元复合物制剂， 其特征是： 由如下重量份数的原料制备而成：透明质酸0.6份、 脂质体6份、 装载有生存素编码基因的重组表达载体1份。3.如权利要求1或2所述的三元复合物制剂， 其特征是： 所述脂质体由如下重量配比的组分组成： DOTAP DOPE=1 1。4.如权利要求1或2所述的三元复合物制剂， 其特征是： 所述生存素编码基因为生存素突变体survivinT34A的编码基因。5.如权利要求3所述的三元复合物制剂， 其特征是： 所述生存素编码基因为生存素突变体survivinT34A的编码基因。6.如权利要求1、 2或5任意一项所述的三元复合物制剂， 其特征是： 所述生存素编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。7.如权利要求3所述的三元复合物制剂， 其特征是： 所述生存素编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。8.如权利要求4所述的三元复合物制剂， 其特征是： 所述生存素编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。9.如权利要求12、 5或78任意一项所述的三元复合物制剂， 其特征是： 所述透明质酸的分子量为10kDa100kDa。10.如权利要求3所述的三元复合物制剂， 其特征是： 所述透明质酸的分子量为10kDa100kDa。11.如权利要求4所述的三元复合物制剂， 其特征是： 所述透明质酸的分子量为10kDa100kDa。12.如权利要求6所述的三元复合物制剂， 其特征是： 所述透明质酸的分子量为10kDa100kDa。13.权利要求112任意一项所述三元复合物制剂的制备方法， 其特征是： 包括如下步骤： 取各重量配比的DOTAP和DOPE， 制备成脂质体， 加入含有生存素编码基因的重组表达载体孵育， 加入透明质酸孵育， 即得。14.如权利要求13所述的制备方法， 其特征是： 所述脂质体采用薄膜分散法制备。15.如权利要求13所述的制备方法， 其特征是： 所述脂质体的制备方法为： 取各重量配比的DOTAP和DOPE溶解在有机溶剂中， 去除有机溶剂形成薄膜， 水化， 即得脂质体。16.如权利要求14所述的制备方法， 其特征是： 所述脂质体的制备方法为： 取各重量配比的DOTAP和DOPE溶解在有机溶剂中， 去除有机溶剂形成薄膜， 水化， 即得脂质体。17.如权利要求15或16任意一项所述的制备方法， 其特征是： 所述有机溶剂为氯仿。18.如权利要求13所述的制备方法， 其特征是： 所述脂质体的制备方法包括以下步骤：将DOTAP和DOPE按照质量比溶解在氯仿中， 在旋转蒸发器上蒸发去除有机溶剂， 所形成的薄膜在真空条件下进一步干燥4小时； 随后将干燥的脂质薄膜在生理盐水中进行水化； 然后通过探针超声， 将脂质体进一步分散至得到半透明的脂质体溶液， 过0.22微米微孔膜， 4储权利要求书1/2 页2CN 109125741 B2存备用。19.如权利要求1416任意一项所述的制备方法， 其特征是： 所述脂质体的制备方法包括以下步骤： 将DOTAP和DOPE按照质量比溶解在氯仿中， 在旋转蒸发器上蒸发去除有机溶剂， 所形成的薄膜在真空条件下进一步干燥4小时； 随后将干燥的脂质薄膜在生理盐水中进行水化； 然后通过探针超声， 将脂质体进一步分散至得到半透明的脂质体溶液， 过0.22微米微孔膜， 4储存备用。20.如权利要求17所述的制备方法， 其特征是： 所述脂质体的制备方法包括以下步骤：将DOTAP和DOPE按照质量比溶解在氯仿中， 在旋转蒸发器上蒸发去除有机溶剂， 所形成的薄膜在真空条件下进一步干燥4小时； 随后将干燥的脂质薄膜在生理盐水中进行水化； 然后通过探针超声， 将脂质体进一步分散至得到半透明的脂质体溶液， 过0.22微米微孔膜， 4储存备用。21.如权利要求13所述的制备方法， 其特征是： 满足以下至少一项：所述加入装载有生存素编码基因的重组表达载体孵育的时间为30分钟；所述加入透明质酸孵育的时间为30分钟；所述透明质酸的浓度为1毫克/毫升。22.权利要求112任意一项所述三元复合物制剂在制备抗肿瘤药物中的用途。权利要求书2/2 页3CN 109125741 B3透明质酸/DOTAP/生存素编码基因自组装的三元复合物制剂及其制备方法技术领域0001本发明涉及透明质酸/DOTAP/生存素编码基因自组装的三元复合物制剂及其制备方法， 属于医药领域。背景技术0002近年来， 以纳米载体为基础的药物输送系统(DDS)极大地影响了临床医学， 例如癌症治疗、 疫苗开发、 组织修复和再生。 在纳米载体的研究中， 脂质体由于其制备工艺简单， 给药方式多样， 并具有潜在的靶向性而应用于多种小分子药物和生物大分子的靶向传递中，得到了许多关注。 由于具有良好的生物相容性和生物降解性， 许多阳离子脂质体已被应用于基因治疗， 在体内外均表现出显著的效果。0003表面电荷被认为是纳米粒子的重要特征之一。 关于核酸的传递， 阳离子脂质体由于其表面具有正电荷， 能通过电荷作用与带有负电荷的核酸(DNA或siRNA)相互作用， 形成lipid核酸复合体(lipoplex)。 这种lipoplexes可通过带负电荷细胞膜， 经过胞吞作用进入细胞。 因此， 脂质体表面电荷对颗粒的细胞吸收和细胞毒性具有重要意义。 虽然在基因治疗中使用阳离子脂质体的优势得到了关注， 但普遍存在的阳离子脂质体的低效和毒副反应一直使阳离子脂质体的应用受到了限制。 在临床试验中， 阳离子脂质体也受到炎症毒性相关不良事件的影响， 如发热、 疲劳和寒战。 因此， 如何寻求和研发有效且安全的靶向阳离子脂质体受到了人们的关注。0004据报道， 透明质酸(HA)是细胞外基质的主要成分之一， 是由重复单位双糖(13)和(14)连接的bd醛酸酸和n乙酰氨基葡萄糖单体)构成。 HA作为一种具有良好生物相容性的水溶性、 生物可降解材料， 已广泛应用于生物工程和药物输送系统领域。 HA作为特异靶向CD44受体的配体， 已被用于一些肿瘤靶向治疗当中， 以提高肿瘤细胞摄取效率。 作为一种阴离子多糖， 带负电荷的HA可以抵消脂质体的正电荷， 减少在生理环境中与组织的非特异性的相互作用减少毒副反应的发生。 目前， 已有用HA修饰的脂质体递送化疗药物或基因药物至肿瘤组织的相关报道。 然而， 现有的修饰方法主要是将HA通过共价键连接在脂质体上，比如， 在EDC的催化下HA的羧基与脂质体磷脂胺基形成酰胺键连接， 或者， HA的还原性末端与磷脂胺基以还原胺化方式连接。 上述方法通过透明质酸与脂质体经化学偶联的方式来制备纳米载体， 不仅操作复杂， 而且容易产生化学残留、 引发安全性问题。0005Survivin(生存素)蛋白突变体survivinT34A， 可通过干扰内源性Survivin磷酸化， 诱导肿瘤细胞自发凋亡， 能够发挥显著的抗肿瘤作用。 目前， 尚未见由透明质酸、 脂质体与survivinT34A编码基因通过自组装制备纳米粒制剂的相关报道。发明内容0006本发明的目的在于提供新型透明质酸/DOTAP/生存素编码基因自组装的三元复合物制剂及其制备方法， 以解决现有用透明质酸修饰脂质体的方法操作复杂、 容易产生化学说明书1/9 页4CN 109125741 B4残留、 安全性低、 活性不理想的问题。0007本发明提供了透明质酸/DOTAP/生存素编码基因自组装的三元复合物制剂， 包含如下重量份数的原料制备而成： 透明质酸0.11份、 脂质体510份、 装载有生存素编码基因的重组表达载体1份， 其中， 所述脂质体包含如下重量配比的组分： DOTAP DOPE1 0.51。0008进一步地， 包含如下重量份数的原料制备而成： 透明质酸0.6份、 脂质体6份、 装载有生存素编码基因的重组表达载体1份。0009进一步地， 所述脂质体包含如下重量配比的组分： DOTAP DOPE1 1。0010进一步地， 所述装载有生存素编码基因的重组表达载体为质粒载体。0011优选地， 所述质粒载体为pVAX质粒载体。0012进一步地， 所述生存素编码基因为生存素突变体survivinT34A的编码基因。0013进一步地， 所述生存素编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。0014进一步地， 所述透明质酸的分子量为10kDa100kDa。0015本发明提供了所述三元复合物制剂的制备方法， 包括如下步骤： 取各重