【发明专利】一种用于糖代谢相关疾病基因治疗的核酸构建体 CN113846124A.pdf

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资源描述
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202111128616.3(22)申请日 2021.09.26(71)申请人 康霖生物科技 (杭州) 有限公司地址 310018 浙江省杭州市杭州经济技术开发区下沙街道福城路291号4-301室(72)发明人 吴昊泉孙保贞党颖(74)专利代理机构 上海光华专利事务所(普通合伙) 31219代理人 王秋霞许亦琳(51)Int.Cl.C12N 15/867(2006.01)C12N 15/16(2006.01)C12N 15/864(2006.01)C12N 5/10(2006.01)A61K 38/26(2006.01)A61P 3/04(2006.01)A61P 3/10(2006.01) (54)发明名称一种用于糖代谢相关疾病基因治疗的核酸构建体(57)摘要本发明涉及基因治疗或生物医药技术领域,特别是涉及一种用于糖代谢相关疾病基因治疗的核酸构建体, 所述核酸构建体包括编码GLP1或其类似物的多核苷酸, 所述GLP1或其类似物的总数量为两个以上, GLP1与GLP1之间、 GLP1与其类似物之间或GLP1类似物与GLP1与类似物之间通过编码连接肽的多核苷酸连接。 本发明的核酸构建体在体内外均可用于高效表达具有活性的GLP1及其类似物, 这为极具潜力的2型糖尿病、 机体代谢紊乱、 糖尿病相关并发症以及肥胖症等糖代谢相关疾病的药物开发了技术路线。权利要求书1页 说明书10页序列表48页 附图6页CN 113846124 A2021.12.28CN 113846124 A1.一种核酸构建体, 其特征在于, 所述核酸构建体包括编码GLP1或其类似物的多核苷酸, 所述GLP1或其类似物的总数量为两个以上, GLP1与GLP1之间、 GLP1与其类似物之间或GLP1类似物与GLP1与类似物之间通过编码连接肽的多核苷酸连接。2.根据权利要求1所述的核酸构建体, 其特征在于, 所述核酸构建体为用于糖代谢相关疾病基因治疗的核酸构建体。3.根据权利要求1所述的核酸构建体, 其特征在于, 糖代谢相关疾病包括糖尿病或其并发症、 肥胖症; 优选的, 所述糖尿病为2型糖尿病。4.根据权利要求1所述的核酸构建体, 其中GLP1或其类似物之间的连接方式如下: 信号肽GLP1或GLP1类似物连接肽GLP1或GLP1类似物连接肽GLP1或GLP1类似物, 其中GLP1或GLP1类似物连接肽GLP1或GLP1类似物单元的个数为一个或多个。5.根据权利要求1所述的核酸构建体, 其特征在于, 所述核酸构建体包括如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的表达框架。6.根据权利要求1所述的核酸构建体, 其特征在于, 所述核酸构建体编码的多肽氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示。7.根据权利要求1所述的核酸构建体, 其特征在于, 所述核酸构建体被用于生产基于病毒的基因治疗载体; 优选的, 所述基因治疗载体为慢病毒载体或腺相关病毒载体。8.根据权利要求7所述的核酸构建体, 其特征在于, 还包括以下任一特征:1)所述慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示;2)所述腺相关病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示。9.一种慢病毒载体系统, 其特征在于, 所述慢病毒载体系统包括权利要求18任一所述的核酸构建体以及辅助质粒。10.根据权利要求9所述的慢病毒载体系统, 其特征在于, 所述慢病毒载体系统还包括携带慢病毒载体的宿主细胞。11.一种慢病毒, 其特征在于, 所述慢病毒由权利要求9或10所述的慢病毒载体系统经病毒包装而成。12.一种腺相关病毒载体系统, 其特征在于, 所述腺相关病毒载体系统包括权利要求18任一所述的核酸构建体以及辅助质粒。13.根据权利要求12所述的腺相关病毒载体系统, 其特征在于, 所述腺相关病毒载体系统还包括携带腺相关病毒载体的宿主细胞。14.一种腺相关病毒, 其特征在于, 所述腺相关病毒由权利要求12或13所述的腺相关病毒载体系统经病毒包装而成。15.一种细胞系, 其特征在于, 所述细胞系为经权利要求11所述的慢病毒或权利要求14所述的腺相关病毒感染的细胞系。16.权利要求18任一所述的核酸构建体、 权利要求9所述的慢病毒载体系统、 权利要求11所述的慢病毒、 权利要求12所述的腺相关病毒载体系统、 权利要求14所述的腺相关病毒、权利要求15所述的细胞系在制备预防、 治疗糖代谢相关疾病的产品中的用途。17.根据权利要求16所述的用途, 其特征在于, 糖代谢相关疾病包括糖尿病或其并发症、 肥胖症; 优选的, 所述糖尿病为2型糖尿病。权利要求书1/1 页2CN 113846124 A2一种用于糖代谢相关疾病基因治疗的核酸构建体技术领域0001本发明涉及基因治疗或生物医药技术领域, 特别是涉及一种用于糖代谢相关疾病基因治疗的核酸构建体。背景技术0002糖尿病是一种身体无法产生完全功能的胰岛素, 或者无法正确利用及储存葡萄糖的疾病。 葡萄糖存留于血液中引起血糖过高并引发一系列并发症为糖尿病的基础。 2型糖尿病, 或称成人型糖尿病、 非胰岛素依赖型糖尿病, 占糖尿病患者中的90左右。 良好的血糖控制对于逆转和减轻2型糖尿病并发症、 降低致残率和死亡率、 改善患者的生活质量至关重要。0003基于胰岛素注射糖尿病治疗取得了一定进展, 但是仍难以实现最佳血糖控制, 在胰岛素注射治疗中伴随的低血糖和体重进一步增加, 会加剧患者机体代谢紊乱以及糖尿病相关并发症, 并导致相关的死亡风险。0004基于胰高血糖素样肽1(glucagonlike peptide1,GLP1)的糖尿病治疗通过增加葡萄糖依赖性胰岛素分泌、 减慢胃排空、 降低餐后高血糖、 减少食物摄入量等机制来安全有效的控制血糖, 同时还能获得减肥和心血管保护等多方面的临床获益作用。 基于GLP1的糖尿病治疗有望代替胰岛素成为治疗糖尿病的一线药物。0005目前主要的基于GLP1的糖尿病治疗包括GLP1受体激动剂和二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase4,DPP4)抑制剂, 均以提高GLP1有效浓度为目标。 其中以Liraglutide(利拉鲁泰), Semaglutide(索马鲁泰)和Dulaglutide(度拉鲁肽)为代表的新的长效胰高血糖素样肽1(GLP1)受体激动剂在临床疗效及患者依从性等方面表现突出,已经作为一线用药进入欧美国家糖尿病指南。0006但GLP1及其类似物在体内很快被DPP4降解, 半衰期较短。 虽然GLP1类似物显著延长了GLP1在体内的作用时间, 但仍需频繁(17天)皮下给药。 并且由于多肽药物的研制、生产、 使用成本均远高于小分子糖尿病治疗药物, GLP1类似物糖尿病治疗并不具有成本优势, 长效以至于终身的GLP1治疗对于部分中重度以及难控制血糖的糖尿病患者, 具有现实及紧迫的临床需求。0007病毒及非病毒载体递送的GLP1类似物基因治疗技术路线, 从理论上解决了GLP1长期甚至终身表达的目标, 可以一劳永逸提高GLP1有效浓度, 对于中重度及难控制糖尿病患者具有长期临床获益的巨大价值。 然而多肽的基因表达载体的表达效率远低于大分子蛋白的基因表达载体, 作为30个氨基酸左右的GLP1及其类似物, 过小的表达框架使其在任何病毒及非病毒载体上的有效表达均有不小的难度。 同时较短血浆半衰期进一步增加了GLP1及其类似物达到有效血液浓度的障碍。 目前为止, 尚未有任何病毒及非病毒载体递送的GLP1类似物基因治疗技术路线获得有效的临床进展。0008针对以上问题, 基于病毒及非病毒载体递送的基因治疗技术路线的药物研发主要需要在以下两个方面取得突破:说明书1/10 页3CN 113846124 A30009如何以重组病毒或非病毒载体递送的基因载体, 以基因组整合或非整合的方式在机体内长期稳定并高效的表达GLP1及其类似物, 使2型糖尿病及相关疾病患者一次治疗长期甚至终身获益, 同时减少生产和使用成本。发明内容0010鉴于以上所述现有技术的缺点, 本发明的目的在于提供一种用于糖代谢相关疾病基因治疗的核酸构建体, 用于解决现有技术中的问题。0011为实现上述目的及其他相关目的, 本发明提供一种核酸构建体, 所述核酸构建体包括编码GLP1或其类似物的多核苷酸, 所述GLP1或其类似物的总数量为两个以上, GLP1与GLP1之间、 GLP1与其类似物之间或GLP1类似物与GLP1与类似物之间通过编码连接肽的多核苷酸连接。0012本发明还提供一种慢病毒, 所述慢病毒由所述核酸构建体经病毒包装而成。0013本发明还提供一种慢病毒载体系统, 所述慢病毒载体系统包括所述的核酸构建体以及辅助质粒。0014本发明还提供一种腺相关病毒载体系统, 所述腺相关病毒载体系统包括所述的核酸构建体以及辅助质粒。0015本发明还提供一种腺相关病毒, 所述腺相关病毒由所述腺相关病毒载体系统经病毒包装而成。0016本发明还提供一种细胞系, 所述细胞系为经所述慢病毒或腺相关病毒感染的细胞系。0017本发明还提供所述核酸构建体、 慢病毒、 慢病毒载体系统、 腺相关病毒、 腺相关病毒载体系统、 细胞系在制备预防、 治疗糖代谢相关疾病的产品中的用途。0018如上所述, 本发明的用于糖代谢相关疾病基因治疗的核酸构建体, 具有以下有益效果: 本发明创造了含串联共价二聚体或多聚体形式的GLP1或其类似物的表达框架的核酸构建体, 该核酸构建体在体内外均可用于高效表达具有活性的GLP1及其类似物, 这为极具潜力的2型糖尿病、 机体代谢紊乱、 糖尿病相关并发症以及肥胖症等糖代谢相关疾病的基因治疗药物开发了技术路线。 本发明的应用范围包括各种形式基于GLP1及其类似物的糖代谢相关疾病的基因治疗, 例如所述构建体能用于病毒载体或非病毒载体递送的糖代谢相关疾病的基因治疗药物的临床研究及新药研发及生产。附图说明0019图1A显示为本发明的pKLkanlentiEF1 WPRE质粒图谱。0020图1B显示为本发明的pAAVMCSCMVEGFP(反)质粒图谱。0021图2显示为表达GLP1受体激动剂的核酸构建体的表达框架的设计。0022图3A显示为表达GLP1受体激动剂的核酸构建体(慢病毒载体)的设计。0023图3B显示为表达GLP1受体激动剂的核酸构建体(腺相关病毒载体)的设计。0024图4A显示为表达GLP1受体激动剂的慢病毒转导细胞后对GLP1受体激动剂的表达(Westernblotting)还原凝胶电泳检测结果。0025图4B显示为表达GLP1受体激动剂的慢病毒转导细胞后对GLP1受体激动剂的表达说明书2/10 页4CN 113846124 A4(Westernblotting)非还原凝胶电泳检测结果。0026图5显示为表达GLP1受体激动剂的慢病毒转导的细胞培养上清对带有GLP1受体细胞的激活效果。 A1A4(即第一行)分别为GLP1(737)8nM,40nM,200nM,1000nM; B1B4(即第二行)分别为KLDi02不同转导体积: 2 L、 5 L、 10 L、 20 L; C1C4(即第三行)分别为KLDi01不同转导体积: 2 L、 5 L、 10 L、 20 L。0027图6显示为DB/DB小鼠接受表达GLP1受体激动剂的腺相关病毒后的血糖浓度。0028图7显示为C57BL/6小鼠接受表达GLP1受体激动剂的腺相关病毒后的糖耐量。具体实施方式0029除非下文另外定义, 本发明所提及的所有技术和科学用语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的意义。0030术语 “核酸构建体” 是指可以被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段, 所述核酸构建体可以为慢病毒载体或腺相关病毒载体, 慢病毒载体或腺相关病毒载体包括载体骨架即空载体与表达框架。0031术语 “表达框架” 是指具有编码蛋白质潜能的序列。0032本发
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