【发明专利】一种基因治疗载体及其用途 CN112522321A.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011486921.5(22)申请日 2020.12.16(71)申请人 北京艺妙神州医药科技有限公司地址 100195 北京市海淀区杏石口路80号B区1号楼3层316号 申请人 北京艺妙医疗科技有限公司(72)发明人 鲁薪安何霆齐菲菲刘光华胡雪莲(74)专利代理机构 北京北翔知识产权代理有限公司 11285代理人 张拥张广育(51)Int.Cl.C12N 15/867(2006.01)C12N 15/12(2006.01)C12N 5/10(2006.01)A61K 48/00(2006.01)A61K 38/17(2006.01)A61P 25/00(2006.01)A61P 25/28(2006.01)A61P 25/14(2006.01) (54)发明名称一种基因治疗载体及其用途(57)摘要本发明涉及一种基因治疗载体及其用途， 该基因治疗载体包括： a)左(5 )LTR； b)Psi()包装信号； c)逆转录病毒输出元件； d)中心多嘌呤区/中央终止序列； e)与编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子； f)编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸； g)转录后调控元件； 以及h)右(3 )LTR。 该基因治疗载体能够体外改造细胞， 使细胞表达CSF1R蛋白， 从而治疗HDLS， 改善HDLS患者的生存状态。权利要求书2页 说明书11页序列表16页 附图3页CN 112522321 A2021.03.19CN 112522321 A1.一种基因治疗载体， 其包括：a)左(5 )LTR；b)Psi( )包装信号；c)逆转录病毒输出元件；d)中心多嘌呤区/中央终止序列；e)与编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子；f)编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸；g)转录后调控元件； 以及h)右(3 )LTR。2.根据权利要求1所述的基因治疗载体， 其中， 所述基因治疗载体为逆转录病毒载体、 腺关联病毒载体、 腺病毒载体或疱疹病毒载体；优选地， 所述基因治疗载体为慢病毒载体。3.根据权利要求2所述的基因治疗载体， 其中， 所述慢病毒选自以下： 人类免疫缺陷病毒、 维斯纳梅迪病毒、 山羊关节炎脑炎病毒、 马传染性贫血病毒、 猫免疫缺陷病毒、 牛免疫缺陷病毒或猿猴免疫缺陷病毒；优选地， 所述慢病毒为人类免疫缺陷病毒。4.根据权利要求13之一所述的基因治疗载体， 其中， 还包括编码表达标签的核苷酸序列；优选地， 所述表达标签为截短的表皮生长因子受体、 萤火虫荧光素酶、 增强的绿色荧光蛋白、 链霉亲和素结合肽标签或Flag标签。5.根据权利要求14之一所述的基因治疗载体， 其中， 所述左(5 )LTR的启动子由选自以下的异源启动子替换： 巨细胞病毒启动子、 劳斯肉瘤病毒启动子或猿猴病毒40启动子。6.根据权利要求15之一所述的基因治疗载体， 其中， 所述右(3 )LTR包括一个或多个修饰；优选地， 所述右(3 )LTR包括防止病毒转录超出第一轮病毒复制的一个或多个缺失；更优选地， 所述右(3 )LTR包括3 LTR的U3区域中TATA框以及Sp1和NF B转录因子结合位点的缺失；进一步优选地， 所述右(3 )LTR是自身失活(SIN)LTR。7.根据权利要求16之一所述的基因治疗载体， 其中， 所述与编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子包括： 短延伸因子1 启动子或其转录活性片段、 骨髓增生性肉瘤病毒增强子阴性对照区域缺失并且dl587rev引物结合位点取代的启动子或其转录活性片段；优选地， 所述与编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子选自以下： 跨膜蛋白119、 整合素亚单元 M、 CD45、 离子钙结合衔接分子1、 CX3C基序趋化因子受体1、 粘附G蛋白偶联受体E1、 CD68或CD40。8.根据权利要求17之一所述的基因治疗载体， 其中， 所述转录后调控元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。9.根据权利要求18之一所述的基因治疗载体， 其中， 所述集落刺激因子1受体多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO： 5所示。权利要求书1/2 页2CN 112522321 A210.根据权利要求19之一所述的基因治疗载体， 其中， 所述编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸序列如SEQ ID NO： 3所示；优选地， 所述编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸是经过密码子优化的表达序列，如SEQ ID NO： 4所示。11.根据权利要求110之一所述的基因治疗载体， 其中， 所述基因治疗载体分别为pMNDCSF1RLV或pEF1 CSF1RLV， 所述pMNDCSF1RLV的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示，所述pEF1 CSF1RLV的核苷酸序列如SEQ ID NO： 2所示。12.一种用基因治疗载体转导的细胞， 其包括根据权利要求111任一项所述的基因治疗载体。13.根据权利要求12所述的细胞， 其中， 所述细胞包括造血干细胞、 干细胞或祖细胞；优选地， 所述细胞为CD34+细胞。14.一种药物组合物， 其包括权利要求111任一项所述的基因治疗载体或权利要求12或13所述的细胞， 以及药学上可接受的载体或赋形剂。15.权利要求111任一项所述的基因治疗载体、 权利要求12或13所述的细胞或权利要求14所述的药物组合物在制备预防、 治疗和减轻遗传性弥漫性白质脑病合并轴索球样变及相关疾病的药物中的用途。16.权利要求111任一项所述的基因治疗载体、 权利要求12或13所述的细胞或权利要求14所述的药物组合物在制备减少或消除集落刺激因子1受体表达的集落刺激因子1受体基因突变的药物中的用途。权利要求书2/2 页3CN 112522321 A3一种基因治疗载体及其用途技术领域0001本发明涉及基因治疗技术领域， 尤其涉及一种基因治疗载体及其用途。背景技术0002遗传性弥漫性白 质脑病合并轴索球样变(HDLS， hereditary diffuse leukoencephalopathy with spheroids)由瑞典医生在1984年首次描述。 临床表现包括认知障碍(记忆力下降、 言语障碍等)， 人格行为改变(抑郁、 淡漠、 焦虑、 易激怒等)， 运动功能障碍(行走困难、 行动失调、 共济失调等)， 容易误诊为艾尔兹海默病、 额颞叶痴呆、 帕金森综合征、 多发性硬化及脑白质病。 发病年龄为47.214.5岁， 平均病程6.03.1年， 死亡年龄为57.213.1岁。 病理表现为额叶、 额顶叶萎缩， 脑室扩张， 脑白质变形， 可观察到髓鞘、 轴突丢失以及大量的轴索球样变。 目前临床尚无有效的HDLS治疗方法， 一般以对症治疗为主，主要包括一般护理、 营养支持、 抗痫药物及抗生素使用。 而对症治疗的方法并不能根治疾病， 只能轻微缓解患者症状。 因此， 急需新的治疗方法以改善HDLS患者的生存状态。发明内容0003有鉴于此， 本发明的目的是提出一种基因治疗载体及其用途， 该基因治疗载体能够体外改造细胞， 使细胞表达集落刺激因子1受体(CSF1R)蛋白， 从而治疗HDLS， 改善HDLS患者的生存状态。0004基于上述目的， 本发明的第一个方面提供了一种基因治疗载体， 该基因治疗载体用于治疗HDLS， 其包括：0005a)左(5 )LTR；0006b)Psi( )包装信号；0007c)逆转录病毒输出元件；0008d)中心多嘌呤区/中央终止序列；0009e)与编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子；0010f)编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸；0011g)转录后调控元件； 以及0012h)右(3 )LTR。0013在本发明的优选的实施方案中， 其中， 所述基因治疗载体可以是逆转录病毒载体、 腺关联病毒(AAV)载体、 腺病毒载体或疱疹病毒载体；0014优选地， 所述基因治疗载体为慢病毒载体。0015在本发明的优选的实施方案中， 其中， 所述慢病毒选自以下： 人类免疫缺陷病毒(HIV)、 维斯纳梅迪病毒(VMV)、 山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、 马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、 牛免疫缺陷病毒(BIV)或猿猴免疫缺陷病毒(SIV)；0016优选地， 所述慢病毒为人类免疫缺陷病毒(HIV)。0017在本发明的优选的实施方案中， 其中， 上述基因治疗载体还包括编码表达标签的说明书1/11 页4CN 112522321 A4核苷酸序列；0018优选地， 所述表达标签为截短的表皮生长因子受体、 萤火虫荧光素酶、 增强的绿色荧光蛋白、 链霉亲和素结合肽标签(Strep tag II)或Flag标签(Flag tag)。0019在本发明的优选的实施方案中， 其中， 所述左(5 )LTR的启动子由选自以下的异源启动子替换： 巨细胞病毒(CMV)启动子、 劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。0020在本发明的优选的实施方案中， 其中， 所述右(3 )LTR包括一个或多个修饰；0021优选地， 所述右(3 )LTR包括防止病毒转录超出第一轮病毒复制的一个或多个缺失；0022更优选地， 所述右(3 )LTR包括3 LTR的U3区域中TATA框以及Sp1和NF B转录因子结合位点的缺失；0023进一步优选地， 所述右(3 )LTR是自身失活(SIN)LTR。0024在本发明的优选的实施方案中， 其中， 所述与编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子包括： 短延伸因子1 (EF1 )启动子或其转录活性片段、 骨髓增生性肉瘤病毒增强子阴性对照区域缺失并且dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子或其转录活性片段；0025优选地， 所述与编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子选自以下： 跨膜蛋白119(TMEM119)、 整合素亚单元 M(CD11b)、 CD45、 离子钙结合衔接分子1(IBA1)、 CX3C基序趋化因子受体1(CX3CR1)、 粘附G蛋白偶联受体E1(F4/80)、 CD68或CD40。0026在本发明的优选的实施方案中， 其中， 所述转录后调控元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。0027在本发明的优选的实施方案中， 其中， 所述集落刺激因子1受体多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO： 5所示。0028在本发明的优选的实施方案中， 其中， 所述编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸序列如SEQ ID NO： 3所示；0029优选地， 所述编码集落刺激因子1受体多肽的多核苷酸是经过密码子优化的表达序列， 如SEQ ID NO： 4所示。0030在本发明的优选的实施方案中， 其中， 所述基因治疗载体分别为pMNDCSF1RLV或pEF1 CSF1RLV， 所述pMNDCSF1RLV的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示， 所述pEF1 CSF1RLV的核苷酸序列如SEQ ID NO： 2所示。0031基于相同的发明构思， 本发明的第二个方面提供了一种用基因治疗载体转导的细胞， 其包括上述的基因治疗载体。0032在本发明的优选的实施方案中， 其中， 所述细胞包括造血干细胞、 干细胞或祖细胞；0033优选地， 所述细胞为CD34+细胞。0034基于相同的发明构思， 本发明的第三个方面提供了一种药物组合物， 其包括上述的基因治疗载体或上述的细胞， 以及药学上可接受的载体或赋形剂。0035基于相同的发明构思， 本发明的第四个方面提供了上述的基因治疗载体、 上述的细胞或上述的药物组合物在制备预防、 治疗和减轻遗传性弥漫性白质脑病合并轴索球样变说明书2/11 页5CN 112522321 A5(HDLS)及相关疾病的药物中的用途； 以及0036上述的基因治疗载体、 上述的细胞或上述的药物组合物在制备减少或消除集落刺激因子1受体(CSF1R)表达