【发明专利】检测2019-nCoV的试剂、试剂盒及应用 CN112553378A.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011593767.1(22)申请日 2020.12.29(71)申请人 广州白云山拜迪生物医药有限公司地址 510000 广东省广州市番禺区万宝北街1号(72)发明人 丘力功陈宋彬郝宇李润明倪世明罗春赵海莲符美娟(74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有限公司 44205代理人 谭英强(51)Int.Cl.C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6844(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称检测2019-nCoV的试剂、 试剂盒及应用(57)摘要本发明公开了检测2019nCoV的试剂、 试剂盒及应用。 该检测2019nCoV的试剂， 包含扩增引物对和/或crRNA； 所述扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示， 所述crRNA的序列如SEQ ID NO.13所示。 该检测2019nCoV的试剂， 可以实现同管一步法稳定、 高灵敏地检测2019nCoV： 无需对RTRPA扩增产物实行移液操作， 从而去除了移液操作产生的扩增产物气溶胶污染的风险， 适合于规模化检测。权利要求书1页 说明书9页序列表3页 附图1页CN 112553378 A2021.03.26CN 112553378 A1.一种试剂， 包含扩增引物对和/或crRNA；所述扩增引物对用于扩增2019nCoV ORF1ab基因特定片段；所述2019nCoV ORF1ab基因特定片段的序列如2019nCoV基因(登录号： MW281864.1)的第1330213396位核苷酸序列所示；所述扩增引物对包括正向引物和反向引物；所述反向引物包含T7启动子序列；所述crRNA包含锚定序列和向导序列， 所述锚定序列与Cas蛋白特异性识别， 所述向导序列与所述2019nCoV ORF1ab基因特定片段的负链特异性识别。2.根据权利要求1所述的试剂， 其特征在于：所述扩增引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述crRNA的序列如SEQ ID NO.13所示。3.权利要求1或2所述的试剂在制备COVID19诊断和/或预后评估的产品中的应用。4.一种试剂盒， 其特征在于： 包含权利要求1或2所述的试剂。5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒还包括Cas蛋白、 信号报告探针。6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于：所述Cas蛋白为Cas13a；所述信号报告探针包含核酸序列， 所述核酸序列的5 端标记荧光报告基团， 3 端标记淬灭基团。7.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于：所述试剂盒还包括RTRPA酶制剂、 RTRPA缓冲液、 T7RNA聚合酶、 RNA酶抑制剂、 NTPs、 醋酸镁、 氯化镁。8.权利要求12中任一项所述的试剂和/或权利要求47中任一项所述的试剂盒在非诊断目的的2019nCoV检测中的应用。9.一种非诊断目的的2019nCoV检测方法， 其特征在于， 包括如下步骤：(1)样本提取： 取待测样本， 提取基因组；(2)如M1)或M2)：M1)： 一步检测： 将步骤(1)提取的基因组与权利要求7所述的扩增引物对、 crRNA、 Cas蛋白、 信号报告探针、 RTRPA酶制剂、 RTRPA缓冲液、 T7RNA聚合酶、 RNA酶抑制剂、 NTPs、 醋酸镁、 氯化镁混合， 进行RTRPA扩增和CRISPR反应检测， 读取检测信号， 即得；M2)： 两步检测：M21)RTRPA扩增： 将步骤(1)提取的基因组与权利要求7所述的扩增引物对、 RTRPA酶制剂、 RTRPA缓冲液混合， 进行RTRPA扩增， 得到扩增产物；M22)CRISPR检测： 将步骤M21)得到的扩增产物与权利要求7所述的crRNA、 Cas蛋白、 信号报告探针、 NTPs、 醋酸镁、 氯化镁混合， 进行CRISPR反应检测， 读取检测信号， 即得。10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于：步骤M1)检测的条件为3638下反应2530min；步骤M21)中RTRPA扩增的条件为3638下反应2530min；步骤M22)中检测的条件为3638下反应2530min。权利要求书1/1 页2CN 112553378 A2检测2019nCoV的试剂、 试剂盒及应用技术领域0001本发明属于基因检测技术领域， 具体涉及检测2019nCoV的试剂、 试剂盒及应用。背景技术0002目前新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019， COVID19)核酸检测普遍采取realtime RTPCR的方法， 自检测试剂盒供应量上来后， 不少案例发现， 试剂盒检测为阴性的， 但是实际已经感染新冠病毒， 而且， realtime RTPCR检测耗时长、 操作复杂， 难以满足疑似病例排查需求。 因此， 对检测试剂盒的灵敏性、 检测速度、 价格、 操作简便性等方面存在改进需求。0003近年来， 一种发展起来的以成簇的、 规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences， CRISPR)为特征的基因检测技术发展起来。 CRISPR是发现于细菌和古细菌的调控型RNA， 含与特定基因互补序列的CRISPR和CRISPR相关蛋白(Cas)形成的复合体具有针对特定基因的内切酶效应， 是近年来十分热门和有前景的基因编辑工具。 在CRISPR/Cas系统中， Cas蛋白在CrRNA(CRISPRderivedRNA， 其基本构成为： 锚定序列+向导序列)的引导下， 识别目标序列后启动 “附带切割” 活性。 一般的CRISPR/Cas系统用于DNA靶序列切割， 2016年张锋研究组首次描述了RNA靶向CRISPR酶， 现在称为Cas13a， 可以用于切割细菌细胞中的特殊RNA序列。 Cas13a与DNA靶向CRISPR酶(如Cas9和Cpf1)不同， 这种酶在切割其靶向RNA后可保持活性， 而且可能表现 “旁切割” (collateral cleavage)， 继续切割其它非靶向RNA。 这意味着Cas13a检测到其靶标后可攻击所有RNA。 这种活性可以被用作一个自动放大检测器， 作为一种低成本的诊断已成为一种可能。 到目前为止， 共发现来源于三种不同种属来具有的旁切割效应的Cas13蛋白， 包括： PsmCas13b、 LwaCas13a和Cca13b， 而且它们之间还有不同的旁切割碱基序列的偏好性。研究结果表明： CRISPR/Cas13和RPA扩增技术(等温扩增技术)结合起来的新系统能够以极低浓度检测单RNA和DNA分子， 可将检测的灵敏度提高到埃摩尔(aM)， 而且检测总时间可控制在40min内。00042020年2月， 张锋教授团队发布了使用基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK技术检测新型冠状病毒的详细操作流程， 其技术方案的特征是用CrRNA/LwaCas13a分别检测2019nCoV S基因和ORF1ab。 其检测是通过两步法实现的： 第一步是加入提取的2019nCoV RNA样品进行RTRPA预扩增,。 第二步是取一定量的扩增产物加入含T7转录酶的CrRNA/LwaCas13a检测液中， 在将第一步的扩增产物重新转录成RNA的基础上检测目标基因。 虽然相比PCR方法这种两步法的检测时间较短， 但缺陷也很明显： 不仅增加了操作次数， 而且预扩增产物开管取样过程极易因气溶胶污染会导致检测结果呈假阳性的风险。 鉴于两步法造成的假阳性风险和操作的不便利很难在临床上推广， 因此对于加入RNA检测样本后无需移管操作且可在同一管内实现RPA扩增基础上的CRISPR检测的一步法反应(onepot reaction)的技术或方法是有客观需求的。 但至目前为止， 只发现张峰在RPA+CAS13联用的技术方案中在检测DNA基因靶标时用到一步法检测； 而在检测包括2019nCoV核酸在内的单链RNA基因靶标方面， 现说明书1/9 页3CN 112553378 A3有公开的文献方法都是两步法， 没有发现提供检测单链RNA的一步法操作的技术方案。发明内容0005为了克服现有引物对/CrRNA不能有效用于一步法检测2019nCoV的问题， 本发明的第一方面的目的， 在于提供一种检测2019nCoV的试剂。0006本发明的第二方面的目的， 在于提供上述试剂在制备COVID19诊断和/或预后评估的产品中的应用。0007本发明的第三方面的目的， 在于提供一种包含检测2019nCoV的试剂的试剂盒。0008本发明的第四方面的目的， 在于提供第一方面的试剂或第三方面的试剂盒在非诊断目的的2019nCoV检测中的应用。0009本发明的第五方面的目的， 在于提供一种非诊断目的的2019nCoV检测方法。0010为了实现上述目的， 本发明所采取的技术方案是：0011本发明的第一个方面， 提供一种检测2019nCoV的试剂， 包含扩增引物对和/或crRNA；0012所述扩增引物对用于扩增2019nCoV ORF1ab基因特定片段；0013所述2019nCoV ORF1ab基因特定片段的序列如2019nCoV基因(登录号：MW281864.1)的第1330213396位核苷酸序列所示；0014所述扩增引物对包括正向引物和反向引物；0015所述反向引物包含T7启动子序列；0016所述crRNA包含锚定序列和向导序列， 所述锚定序列与Cas蛋白特异性识别， 所述向导序列与所述2019nCoV ORF1ab基因的负链特异性识别。0017优选的， 所述T7启动子的序列为TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO.14)或GAAATTAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO.15)。0018优选的， 所述扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。0019优选的， 所述crRNA的序列如SEQ ID NO.13所示。0020本发明的第二个方面， 提供本发明第一方面的试剂在制备COVID19诊断和/或预后评估的产品中的应用。0021本发明的第三方面， 提供一种包含第一方面的试剂的试剂盒。0022所述试剂盒还包括Cas蛋白、 信号报告探针。0023所述Cas蛋白优选为Cas13a； 更优选为LwaCas13a。0024所述信号报告探针包含核酸序列， 所述核酸序列的5 端标记荧光报告基团， 3 端标记淬灭基团。0025所述信号报告探针的核酸序列为UUUUU。0026所述试剂盒还包括RTRPA酶制剂、 RTRPA缓冲液、 T7RNA聚合酶、 RNA酶抑制剂、NTPs、 醋酸镁、 氯化镁。0027本发明的第四方面， 提供第一方面的试剂和/或第三方面的试剂盒在非诊断目的的2019nCoV检测中的应用。0028本发明的第五方面， 提供一种非诊断目的的2019nCoV检测方法， 包括如下步骤：0029(1)样本提取： 取待测样本， 提取基因组；说明书2/9 页4CN 112553378 A40030(2)如M1)或M2)：0031M1)： 一步检测： 将步骤(1)提取的基因组与上述扩增引物对、 crRNA、 Cas蛋白、 信号报告探针、 RTRPA酶制剂、 RTRPA缓冲液、 T7RNA聚合酶、 RNA酶抑制剂、 NTPs、 醋酸镁、 氯化镁混合， 进行RTRPA扩增和CRISPR反应检测， 读取检测信号， 即得；0032M2)： 两步检测：0033M21)RTRPA扩增： 将步骤(1)提取的基因组与上述扩增引物对、 RTRPA酶制剂、 RTRPA缓冲液混合， 进行RTRPA扩增， 得到扩增产物；0034M22)CRISPR检测： 将步骤M21)得到的扩增产物与上述crRNA、 Cas蛋白、 信号报告探针、 NTPs、 醋酸镁、