DB11∕T 1397-2017 鱼类口服抗菌药物选用技术规程.pdf

ICS 65.150 B 50 备案号:54176- 2017 DB11 北京市地方标准 DB11/T 13972017 鱼类口服抗菌药物选用技术规程 The technical protocol of screening oral antibacterials for fish 2017 - 03 - 22 发布 2017 - 07 - 01 实施 北京市质量技术监督局 发 布 DB11/T 13972017 I 前 言 本标准根据GB/T 1.12009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由北京市农业局提出并归口。 本标准由北京市农业局组织实施。 本标准起草单位：北京市水产技术推广站。 本标准主要起草人：王小亮、王静波、王姝、曹欢、张文、王澎、徐立蒲、那立海。 DB11/T 13972017 1 鱼类口服抗菌药物选用技术规程 1 范围 本标准规定了鱼类口服抗菌药物选用原则、程序和操作流程。 本标准适用于养殖鱼类细菌感染判断和治疗时口服抗菌药物选用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27623.12011 渔用抗菌药物药效试验技术规范 第1部分： 常量肉汤稀释法药物敏感性试验 SC/T 70142006 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7201.12006 鱼类细菌病检疫技术规程 第1部分：通用技术 3 药物选用原则和程序 3.1 原则 抗菌药物使用应遵循以下原则： 药物种类应符合国家有关标准，药品应获得国家批准文号； 选择 GMP 认证企业生产的抗菌药物； 使用的优先顺序是磺胺类四环素类氨基糖苷类氟喹诺酮类酰胺醇类。 3.2 程序 鱼类口服抗菌药物的选用程序参见附录A。 4 操作流程 4.1 病鱼采集 病鱼采集按SC/T 70142006第6章的规定进行。 4.2 病原菌的分离 病原菌的分离参见附录B。附录B中的BHIA的培养基配方参见C.1。 4.3 细菌感染判断 任何一个划线分离平板，线上有菌落或菌带，则该样品来源养殖池塘的鱼类宜用口服抗菌药物；反之，则不必使用。 DB11/T 13972017 2 4.4 敏感药物筛选 采取纸片扩散法（参见D.3）筛选敏感药物种类。依检测结果选择敏感药物种类，原则如下： 一个样品仅获得一株病原菌，选择该菌的敏感药物种类； 一个样品获得多株病原菌，选择共同的敏感药物种类； 一个样品获得多株病原菌，且无共同的敏感药物种类，选择内脏器官分离菌的敏感药物种类，优先选取肝、肾分离菌的敏感药物种类。 4.5 用药剂量确定 4.5.1 检测病原菌的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC） 采用浓度梯度稀释法（参见D.4）检测其对样品所有病原菌的MIC值。 4.5.2 计算样品每千克鱼的日用药剂量 按4.5.1检测样品所有病原菌的MIC值，同种药物选取最大的MIC值。每种敏感药物按公式（1）计算样品每千克鱼的日用药剂量，每千克鱼的日用药剂量不超过国家兽药规定的使用许可值。 =SMICU . (1) 式中： U 每千克鱼的日药物使用剂量（指有效成分剂量），单位为毫克每千克（mg/kg）； MIC 抗菌药物对病原菌的MIC值，单位为毫克每升（mg/L）； S 系数，鲤科鱼类为8.1，冷水鱼类为9.4，养殖者可依经验微调该系数； 水的密度，数值约为1，单位为千克每升（kg/L）。 4.5.3 计算样品池塘的日药物总使用剂量 每种敏感药物按公式（2）计算样品池塘的日总用药剂量。 1000=TUM . (2) 式中： M 样品池塘的日药物总使用剂量（指有效成分剂量），单位为克（g）； U 每千克鱼的日药物使用剂量（指有效成分剂量），单位为毫克每千克（mg/kg）； T 样品池塘养殖鱼类的总重量，单位为千克（kg）。 4.6 使用方法 将样品鱼来源池塘的饵料日投喂量减少一半。将4.5.3确定的日药物总使用剂量溶解拌入饵料中，充分混匀，一次性投喂使用。 4.7 用药效果评价 用药后，按以下原则判断用药效果： 如用药后 3 d5 d，日死亡数量明显下降或疾病的症状改善甚至消失，则认定药物治疗有效； 如用药后 3 d5 d，鱼的日死亡数量保持治疗前的水平或者超过治疗前的水平，则认定药物治疗无效。 DB11/T 13972017 3 A A 附 录 A （资料性附录） 鱼类口服抗菌药物选用程序 图A.1 鱼类口服抗菌药物选用程序示意 是 否 发病池 敏感药物筛选 用药剂量确定 使用方法 病鱼不用抗菌药物 治疗 及用药效果评价 平板线上是否有 菌落或菌带 病鱼采集 病原菌的分离 DB11/T 13972017 4 B B 附 录 B （资料性附录） 病原菌的分离 B.1 设备和材料 B.1.1 普通天平：0 g210 g，精确至0.01 g。 B.1.2 高压灭菌锅。 B.1.3 微波炉。 B.1.4 生物安全柜或超净工作台。 B.1.5 生物显微镜：10，40，100。 B.1.6 培养皿：直径90 mm。 B.1.7 酒精灯、解剖盘、解剖刀、剪子、镊子、接种环（针） 、三角烧瓶（500 mL）等。 B.1.8 试剂和培养基 B.1.9 水：GB/T 6682，二级。 B.1.10 脑心浸液琼脂（Brain Heart Infusion Agar, BHIA） ：参见C.1。 B.2 取样部位 病灶、肝、肾、脾、性腺、脑。 B.3 病原菌分离 B.3.1 冷水鱼病原菌分离 用接种环从取样部位蘸取病料，无菌操作划线接种于BHIA平板， 22 2 培养24 h48 h，无菌生长时继续培养至5d。 B.3.2 温水鱼病原菌分离 用接种环从取样部位蘸取病料，无菌操作划线接种于BHIA平板，28 2 培养24 h48 h，无菌生长时继续培养至5d。 DB11/T 13972017 5 C C 附 录 C （资料性附录） 培养基的配制方法 C.1 脑心浸液琼脂（BHIA） C.1.1 成分 牛脑浸粉 12.5 g 牛心浸粉 5.0 g 蛋白胨 10.0 g 葡萄糖 2.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钠 2.5 g 琼脂 10 g 蒸馏水 1000 mL C.1.2 制法 将C.1.1 中各成分混匀，加热溶解，调pH至7.40.1，121 高压灭菌20 min，冷至50 左右，倾制平板。 C.2 水解酪蛋白琼脂（MHA） C.2.1 成分 牛肉浸膏 6.0 g 酸水解酪蛋白胨 17.5 g 可溶性淀粉 1.5 g 琼脂 17.0 g 蒸馏水 1000 mL C.2.2 制法 将C.2.1中各成分混匀，加热溶解，调pH至7.30.1，121 高压灭菌15 min，冷至50 左右，倾制平板。平板中的培养基厚度4 mm。 C.3 水解酪蛋白肉汤（MHB） C.3.1 成分 牛肉浸膏 6.0 g 酸水解酪蛋白胨 17.5 g 可溶性淀粉 1.5 g DB11/T 13972017 6 蒸馏水 1000 mL C.3.2 制法 将C.3.1中各成分混匀，加热溶解，调pH至7.30.1，121 高压灭菌15 min。如检测链球菌，临用前加无菌血清0.5%。 DB11/T 13972017 7 D D 附 录 D （资料性附录） 病原菌的药物敏感性检测 D.1 设备和材料 D.1.1 恒温培养箱：0 60 。 D.1.2 精密天平：精确至0.0001 g。 D.1.3 高压灭菌锅。 D.1.4 比浊仪。 D.1.5 生物安全柜或超净工作台。 D.1.6 生物显微镜：10，40，100。 D.1.7 微量移液器：100 L1000 L，10 L100 L。 D.1.8 多通道移液器：50 L300 L。 D.1.9 培养皿：直径90 mm。 D.1.10 试管、试管架：15 mm150 mm，15 mm100 mm。 D.1.11 微孔板（500 L/孔） 。 D.1.12 一次性针头过滤器（0.22 m） 、注射器（5 mL） 。 D.2 试剂和培养基 D.2.1 水：GB/T 6682，二级。 D.2.2 0.45%氯化钠缓冲液。 D.2.3 二甲基甲酰胺：分析纯。 D.2.4 氢氧化钠：分析纯。 D.2.5 75%酒精。 D.2.6 药敏纸片。- 20保存，药物种类及其溶解试剂见表D.1。药敏纸片可从可靠的供应商采购或自行制备。 D.2.7 抗菌药物标准品。抗菌药物种类参见表D.1，标准品由兽药管理部门指定单位提供。 D.2.8 水解酪蛋白琼脂（Mueller- Hinton Agar, MHA） ：参见C.2。 D.2.9 水解酪蛋白肉汤（Mueller- Hinton Broth, MHB） ：参见C.3。 D.3 纸片扩散法 D.3.1 制备菌悬液 从培养16 h24 h的BHIA斜面上挑取纯培养菌，用0.45%氯化钠缓冲液配制成1.0108CFU/mL2.0108 CFU/mL的菌悬液。 D.3.2 接种平板 制好的菌悬液应在15 min内使用。用微量移液器取100 L到MHA平板上，灭菌玻璃涂布棒涂匀。 DB11/T 13972017 8 D.3.3 贴药敏纸片 用灭菌的镊子取药敏纸片贴到D.3.2接种好的MHA平板上， 镊子轻按药敏纸片， 使药敏纸片与培养基紧密相贴。每个培养皿均匀贴四片，标记药物名称、菌株名称和培养时间等。于28 2 (杀鲑气单胞菌为22 2 )孵育15 min。 D.3.4 测抑菌圈直径 将D.3.3孵育后的平板倒置于28 2 (杀鲑气单胞菌为22 2 )生化培养箱中，培养24 h2 h后，观察结果。用游标卡尺或直尺测量抑菌圈直径（mm）。 D.3.5 结果解释 按照表D.1的标准对抑菌圈大小作出解释，判断病原菌对抗菌药物敏感或耐药。 表D.1 鱼类病原菌的抑菌圈直径解释标准和相对应的最低抑菌浓度值（MIC） 药物种类 药 名 配制母液的溶剂 药敏片含量 （g/片） MIC（mg/L） 抑菌圈直径（mm） 敏感 耐药 耐药 敏感 磺胺类药物 磺胺甲噁唑 1 mol/L NaOH 300 100 350 14 17 磺胺类药物 磺胺嘧啶 1 mol/L NaOH 300 100 350 14 17 磺胺类药物 磺胺二甲嘧啶 1 mol/L NaOH 300 100 350 14 17 磺胺类药物 磺胺间甲氧嘧啶 1 mol/L NaOH 300 100 350 13 17 四环素类 盐酸多西环素 蒸馏水 30 4 16 13 16 氨基糖苷类 硫酸新霉素 蒸馏水 10 4 16 12 16 酰胺醇类 氟苯尼考 0.1 mol/L 二甲基甲酰胺 30 4 16 13 18 酰胺醇类 甲砜霉素 0.1 mol/L 二甲基甲酰胺 30 4 16 12 16 氟喹诺酮类 恩诺沙星 2.5 mol/L NaOH 5 2 8 12 16 D.4 浓度梯度稀释法 D.4.1 菌悬液制备 按D.3.1制备的菌悬液，用灭菌的MHB稀释100倍备用。 D.4.2 抗菌药物的配制 将不同种类的抗菌药物用相应溶剂溶解后（参见表D.1），用蒸馏水稀释、定容。磺胺类药物配成10240 mg/L的原液，其它药物配成1280 mg/L。用一次性针头过滤器过滤后，4 冰箱保存，2 d内使用。 D.4.3 抗菌药物药液浓度梯度的建立 操作方法按GB/T 27623.12011中的第5.2条款执行。 D.4.4 菌液接种 在上述制备的药液浓度梯度的试管中，每管加0.1mL的新鲜配制好的待测菌悬液，混匀。 D.4.5 孵育 DB11/T 13972017 9 接种菌悬液后，尽快置于28 2 (杀鲑气单胞菌为22 2 )下培养24 h48 h，每24 h观察并记录一次结果。 D.5 结果记录 按GB/T