BJS 201915 含乳饮料及其乳原料中酪蛋白含量的测定.pdf

1 附件 4 含乳饮料及其乳原料中酪蛋白含量的测定 BJS 201915 1 范围 本方法规定了含乳饮料及其原料中酪蛋白四种亚型 s1-酪蛋白、s2-酪蛋白、-酪蛋白、-酪蛋白含量测定的方法。 本标准适用于含乳饮料及其原料中酪蛋白总含量的测定，不适用于发酵法、酶解法、水解法等工艺对蛋白质改性的样品。 2 原理 试样溶液中的酪蛋白采用等电点沉淀后复溶， 用胰蛋白酶进行酶解， 同时加入同位素内标，C18水相柱分离，采用液相色谱-串联质谱仪检测，内标法定量。 3 试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 3.1 试剂 3.1.1 浓盐酸（HCl） 。 3.1.2 甲酸（CH2O2） ：质谱级。 3.1.3 醋酸（CH3COOH） ：色谱级。 2 3.1.4 氯化钠（NaCl） 。 3.1.5 乙腈（CH3CN） ：质谱级。 3.1.6 三羟甲基氨基甲烷（Tris，C4H11NO3） 。 3.1.7 聚乙二醇辛基苯基醚 （Triton X-100, C34H62O11） 。 3.1.8 胰蛋白酶（Trypsin，C6H15O12P3） ：质谱级，猪源、牛源、基因工程来源均可；建议采用基因工程级的胰蛋白酶以降低杂酶的影响。 3.2 试剂配制 3.2.1 盐酸溶液（6 mol/L） ：吸取 25 mL 浓盐酸，用水稀释并定容至 50 mL。 3.2.2 甲酸溶液（10% V/V） ：吸取 1 mL 甲酸，用水稀释并定容至 10 mL。 3.2.3 醋酸溶液（0.3% V/V） ：吸取 0.3 mL 醋酸，用水稀释并定容至 100 mL。 3.2.4 氯化钠溶液 （0.5 mol/L，含 0.2% Triton-X 100） ：称取 14.625 g，加 200 mL 水溶解后，加入1 mL Triton X-100（3.1.7） ，混匀溶解后，用水定容至 500 mL。 3.2.5 Tris-HCl 溶液 （50 mmol/L） ： 称取 6.057 g Tris， 加 900 mL 水溶解， 用 6 mol/L 盐酸溶液 （3.2.1）调 pH 至 8.5 后，用水定容至 1000 mL，经 0.45 m 微孔滤膜过滤，备用。 3.2.6 胰蛋白酶液：用醋酸溶液（3.2.3）将胰蛋白酶粉末溶解至 1 mg/mL 后，按照单次使用量进行稀释分装， 如每瓶 50 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。 L 或 100 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。 L 的 0.2 mg/mL 胰蛋白酶，-80C 冷冻保存，避免反复冻融。 3.2.7 蛋白质浓度测定试剂盒（基于考马斯亮蓝-Bradford 测定法或 BCA 蛋白质测定法均可） 。 3 3.2.8 甲酸水溶液（0.1% V/V） ：吸取 0.5 mL 甲酸，用水稀释并定容至 500 mL。 3.3 标准品 3.3.1 s1-酪蛋白特征肽标准品：YLGYLEQLLR，纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质。 3.3.2 s2-酪蛋白特征肽标准品：FALPQYLK，纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质。 3.3.3 -酪蛋白特征肽标准品：VLPVPQK，纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质。 3.3.4 -酪蛋白特征肽标准品：YIPIQYVLSR，纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质。 3.3.5 s1-酪蛋白特征肽内标标准品： PSERYLGYL*（13C6，15N） EQLLRLKKY， HPLC 级纯度 98%。 3.3.6 s2-酪蛋白特征肽内标标准品：RYQKFALPQYL*（13C6，15N）KTVYQ，HPLC 级纯度 98%。 3.3.7 -酪蛋白特征肽内标标准品：SQSKVL*（13C6，15N）PVPQKAVPY，HPLC 级纯度 98%。 3.3.8 -酪蛋白特征肽内标标准品：KIAKYIPIQYVL*（13C6，15N）SRYPSY，HPLC 级纯度 98%。 L*（13C6，15N）同位素标记亮氨酸，以上标准品的相对分子量见附录 A 表 A1。 3.4 标准溶液配制 3.4.1 标准储备溶液（400 mol/L） ：根据标准品纯度及肽段标准品相对分子量计算不同酪蛋白亚型（3.3.1-3.3.4）称样量，精确称取适量（精确至 0.01 mg）标准品后，用 Tris-HCl 溶液（3.2.5）溶解，定容于 10 mL 容量瓶中，各酪蛋白亚型特征肽（3.3.1-3.3.4）浓度均为 400 mol/L，此溶液密封后-20 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。冷冻保存，有效期 3 个月。 3.4.2 混合标准溶液：准确吸取各酪蛋白亚型特征肽标准储备液（3.4.1）1 mL 至 100 mL 容量瓶中，加入 Tris-HCl 溶液（3.2.5）稀释至刻度，得到各酪蛋白亚型特征肽浓度为 4 mol/L 的混合标准溶 4 液，此溶液密封后-20 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。冷冻保存，有效期 1 个月。 3.4.3 混合标准工作溶液：准确吸取混合标准溶液（3.4.2） ，用纯水稀释，配制成浓度依次为 0.02 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L、1.0 mol/L、2 mol/L 的系列混合标准工作液， -20 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。冷冻保存，有效期 1 周。 3.4.4 内标标准储备溶液（10 mol/L） ：根据标准品纯度及肽段标准品相对分子量计算不同酪蛋白亚型 （3.3.5-3.3.8） 称样量， 精确称取适量 （精确至 0.01 mg） 内标标准品后， 用 Tris-HCl 溶液 （3.2.5）溶解，配制成各酪蛋白亚型特征肽（3.3.5-3.3.8）浓度均为 10 mol/L 的内标标准储备溶液，此溶液密封后-20 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。冷冻保存，有效期 3 个月。 3.4.5 内标混合标准溶液：准确分别吸取 0.25 mL 各酪蛋白亚型特征肽内标标准储备溶液（3.4.4）混合，配制成浓度为 2.5 mol/L 内标混合标准溶液 1 mL，-20 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。冷冻保存，有效期 1 个月。 3.4.6 混合标准品酶解溶液：分别准确吸取 500 L 各系列混合标准工作溶液（3.4.3）到 2 mL 低吸附聚丙烯 （PP） 离心管中， 向每个浓度中加入 40 L 内标混合标准溶液 （3.4.5） ， 再加入 5 L 的 0.2 mg/mL 的胰蛋白酶液 （3.2.6） （含 1 g 胰蛋白酶） ， 用纯水定容至 1 mL 后充分涡旋， 在 1000 r/min，4 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。条件下，离心 1 min。盖紧瓶盖，在 37 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。水浴或者恒温箱内孵育 15-16 h 后，取出加入 20 L 10% 的甲酸溶液（3.2.2）终止酶解反应。混匀后，在 10 000 r/min，4 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。条件下离心 10 min，静置，取上清液备用。上清液在-20 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。冷冻保存放置 4-5 天内稳定。 3.5 材料 3.5.1 低吸附型 2 mL、15 mL、50 mL 聚丙烯（PP）离心管。 5 3.5.2 低吸附型聚丙烯（PP）枪头。 3.5.3 低吸附型聚苯乙烯（PS）96 孔板（用于总蛋白含量测定） 。 4 仪器和设备 4.1 高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 4.2 酶标仪。 4.3 分析天平：感量分别为 0.001 g、0.000 1 g 和 0.000 01 g。 4.4 低温离心机：转速6 000 r/min。 4.5 恒温水浴锅或可控温培养箱。 4.6 pH 计。 4.7 涡旋振荡器。 5 分析步骤 5.1 试样蛋白提取 含乳饮料固体试样（若含乳包装为独立包装，应与其他调味粉末混合后取样，例如：咖啡、奶茶等饮品） ：试样称取 1 g5 g (精确至 0.001 g) 于锥形瓶中；若为乳饮料液体试样：精密量取试样10 mL 于锥形瓶中，加入 30 mL 预温（40 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。 ）的 Tris-HCl 溶液（3.2.5） ，混匀后，放入 60 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。水浴恒温振荡 1 h，取出冷却后用 Tris-HCl 溶液（3.2.5）转移定容至50 mL 容量瓶（V溶解体积） 。 乳粉原料粉试样：称取试样 0.5 g1 g (精确至 0.001 g) 于锥形瓶中；若为液体乳试样：精密量 6 取试样 12 mL 于锥形瓶中， 加入 30 mL 预温 （40 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。 ） 的 Tris-HCl 溶液 （3.2.5） ，混匀后，放入 60 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。水浴恒温振荡 1 h，取出冷却后用 Tris-HCl 溶液（3.2.5）转移定容至 50 mL 容量瓶（V溶解体积） 。 精密量取 10 mL（V沉淀体积）上述完全溶解的试样溶液（视检无明显结块） ，按体积比（v/v =1:1）加入 10 mL 氯化钠溶液（3.2.4）, 涡旋振荡。混匀后，用 10% 甲酸溶液（3.2.2）调节试样的 pH值到 4.64.8 之间，2-8 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。条件下静置过夜，待所有蛋白沉淀析出。已析出的沉淀试样在 10000 r/min，4 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。条件下离心 15 min，弃去上清液，沉淀以备复溶。 5.2 试样复溶 向上述沉淀试样（5.1）中加入 5 mL Tris-HCl 溶液（3.2.5） ，涡旋振荡 510 min，使溶液充分溶解，放入 60 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。水浴恒温振荡 30 min，取出后继续混匀（视检无明显结块） 。试样溶液在 10 000 r/min， 4 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。条件下离心 15 min，弃去沉淀，留取上清液。上述步骤重复 1 次，合并两次复溶的上清液后，可用 Tris-HCl 溶液（3.2.5）定容至 10 mL（V复溶体积） 。 5.3 试样总蛋白的含量测定 按照 Bradford 或 BCA 法试剂盒所述方法测定复溶试样溶液（5.2）中总蛋白质的含量（单位：mg/mL） 。 5.4 试样的稀释 为保证该实验在最佳的酶解效率下进行，需根据试样中总蛋白的含量测定结果（5.3）, 用Tris-HCl 溶液（3.2.5）对复溶后的试样溶液进行稀释（f3稀释倍数） ，使试样稀释液中的总蛋白含量保持在 0.2 mg/mL0.7 mg/mL 之间。 5.5 试样的酶解 7 该实验的最佳酶解效率为：酶的质量/总蛋白质量（w/w）=1:20，根据此原则推算，若试样稀释液中总蛋白含量在 0.2 mg/mL0.7 mg/mL 之间，按取样量 200 L 进行酶解（V酶解体积） ，则其对应的总蛋白质质量范围在 40 g140 g 之间，加入胰蛋白酶的量则在 2 g7 g 范围内。 取 200 L （V酶解体积）稀释后的试样（5.4） ，按照上述计算依据，加入适量胰蛋白酶液（3.2.6） ，向试样中加入 40 L 内标混合标准溶液（3.4.5） ，用纯水定容至 1 mL（V定容体积）后充分涡旋，在1000 r/min，4 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。条件下，离心 1 min。盖紧瓶盖，在 37 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。水浴或者恒温箱内孵育 15-16 h 后，取出加入 20 L 10% 的甲酸溶液（3.2.2）终止酶解反应。混匀后，在 10000 r/min，4 错误错误!未找到引用源。未找到引用源。条件下离心 10 min，静置，上清液以备分析。 注：当回收率达不到本标准要求时，应考虑对蛋白酶活力进行评价。可以选用市售标准蛋白质质控样品（标明准确蛋白含量且已知目标肽段分子量的产品）随行酶解步骤，