重组大肠杆菌P84A∕MC1061诱导和表达卤醇脱卤酶的条件优化.pdf

2 0 1 2V O I 3 1N O 2 12 8 S e 蒯N o 2 3 9 C h i n aB r e w i n g R e s e a r c hR 印o r t 重组大肠杆菌P 8 4 M C l 0 6 1 诱导和表达卤醇脱卤酶的条件优化 李建华，李啸“执，张娅，余华顺z ，姚娟：，李沛z ，梁运祥，李知洪：，俞学锋。 ( 1 三峡大学化学与生命科学学院，湖北宜昌4 4 3 0 0 3 ；2 安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌4 4 3 0 0 3 ； 3 华中农业大学生命科学与技术学院，湖北武汉4 3 0 0 6 8 ) 摘要：考察重组工程菌E c o J f P 8 4 刖M c l 0 6 1 的生长特性，并优化其在卤醇脱卤酶表达过程中的诱导条件和培养条件。在摇瓶发酵 中，以阿拉伯糖诱导重组大肠杆菌P 8 4 射M c l 0 6 l 表达卤醇脱卤酶。重点研究培养温度、装液量! 摇床转速、培养基初始p H 值、诱导时 机、诱导剂添加量、诱导剂作用时间对卤醇脱卤酶的表达影响。在培养温度为3 0 ，装液量为2 5 m U 2 5 0 m L ，摇床转速为2 0 0 r m i n ，初始 p H 值为7 1 时，当菌体量0 值达到2 时，按照l 体积比添加L 阿拉伯糖，诱导培养2 2 h 后，发酵液O D 值达到2 1 3 ，酶活力达到 1 3 8 5 5 5 - 3 U 札。研究发现，培养温度和初始p H 值是基因工程菌E c o J j P 8 4 刖M c l 0 6 l 诱导表达卤醇脱卤酶的显著影响因子，可为卤醇 脱卤酶发酵生产的深入研究提供依据。 关键词：卤醇脱卤酶；大肠杆菌：发酵条件；诱导 中图分类号：Q 7 8 6 文献标识码：A文章编号：0 2 5 4 5 0 7 1 ( 2 0 1 2 ) 0 2 _ 0 1 2 8 0 4 o p t i m j 删0 no f i n d u c i n ga n d 唧糟s s i o nc o n d i t i o 璐f o r 托c 伽曲i n a n tE c o 王fP 8 4 A M C l 0 6 1t 0p r o d eh a l o g a l c o h o li l e h a l o 留e n a s c s uJ i a l l I l u a l ，uX i a o “，z H A N GY a l ，Y UH u a s h I l I l 2 ，Y A oJ u a I l 2 ，L IP e i 2 ，L M N GY l i 孤旷，u 办i h o 醇，Y ux u e f b n 乎 i C o l l e 薛o fc l l 锄i s 圩ya n dL 涤s c i e n c e ，C l l i l l a1 m eG o r g e sU n i v e r s 咄Y i c h a n g4 4 3 3 。C h 岫；2 缸g e lY 黜tC o ，L n 。 Y i c h a n g4 4 3 0 0 3 C h i m ：3 C d l e 驴o f F 0 0 ds c i e n c ea n dT e c b n o l o g y H 1 l a 曲o n gA 曲c u l t 瑚_ a lU 面v e r 8 i 钦W u b a n4 3 0 0 6 8 。C h i n a ) A b 蚰c t ：G r o w 血d l a r a c t e r i s I i c so f I h er c c o m b i n a n tg e n e I i ce n g i n e e r i n g b a c t e r i aEc 洲P 8 4 M 舵1 0 6 1w c r ci n v c 幽g a t e da n d i n d u c i l l ga n dc u l t I l r i n g c o n d i t i o 璐矗竹p r o d I I c i r 培h “o g e na l c o h o ld e h a l o g e n a s e sw e r eo p t i m i z e d L ( + ) 一A r a b i n o s ew a su s e dt oi n d u c eE c o 盯P 8 4 A M C l 0 6 1t oe x p s s H a I o g e na l c o h 0 1d e h a l o g e n a s e si ns h a k i n gn a s l ( sf 咖n e n t a t i o n A n d1 1 1 es t I I d yw a sf b c u s e do nt e m p e r a t u r e ，矗1 1 i n gV 0 1 啪eo f m e d i u m ，r o t a d o ns p e e d ， “l i “m e d i 啪p H ，i n d u c i n gt i m i n g 卸da d d i n g 锄叫l to f t l l ei n d u c c fw 船f o c u s e di nm es t I l d y 1 1 1 e0 p 劬a lc o n d i I i o n s 盯ca sf 0 1 1 0 w s ：t e m p e r a t I l r c 3 0 ，m e d i 眦f i l I i n gv o l 眦e2 5 m 汜5 0 r n l ，r o t a t i o ns p e e d2 0 0 r I 血，砌i a lp Hv a 】u c7 1 ，a n dL ( + ) A r a b i n o s ew 8 sa d d e d1 0f e r m e n 蜥o nb r o 山w h e n 0 D r e h e dt o2 砸t I Im ec o n c e n 廿a h o no fl U n d e rt l l e 叩t i m a lc o n d i t i o n ，m e0 日啪a n dt h e 衄纠m ea c t i v i t y 碥a c h e d2 1 3 姐d1 3 8 5 5 5 3 U 枷， r e S p e c 帆l y 1 1 1 ec u l t u r et e m p e r a t I l r e 孤1 di 1 1 谢a lm e d i 眦p Hv a l u ew e r es i 印i f i c a n t 妞c t o r sf o rEc o 盯P 8 4 觚肥1 0 6 lt 0e x p r e s sh a l o 唧a l c o h o l d e h a l o g e n a s e s K c yw a r d s h a l o g e na I c o h 0 1d e h a l o g c n a s e s ；E c o j i ；f e m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ；i n d u c t i o n 随着化工业的飞速发展，有机卤化物污染土壤及水源 的现象日趋严重川。1 9 6 8 年C A S T R OC E 等 2 首次发现了 以2 ，3 二溴丙醇作为唯一碳源而生存的黄杆菌( F J a v o b a f 撕l I ms p ) 。现在，已有多篇文献报道关于能降解邻卤醇的 微生物。 卤醇脱卤酶也叫卤醇卤化氢裂解酶，通过分子内亲核 收稿日期：2 叭1 - l O - 1 8 作者简介：李建华( 1 9 8 4 ) ，男，硕士研究生，研究方向为发酵工程：李啸+ ，副教授，通讯作者。 3 结论 本次试验从豉香型白酒发酵环境中分离得到一株优 良产酯酵母，试验室命名为产酯1 号。该菌株本次试验表明 产酯1 号在接种量为5 、p H 值为6 、3 2 、发酵5 d 的情况下 产乙酸乙酯能力最高：将该产酯酵母在豉香型白酒生产中 进行了初步的强化应用，取得了一定的效果，可提高乙酸 乙酯量4 9 ，同时酒体口感评价更优。 参考文献： 【1 李大和试论豉香型白酒独特风格的成因明酿酒科技，2 0 0 4 ，1 2 l ( 1 ) ： 2 4 2 7 ， 2 李福荣信阳民间传统米酒微生物的分离及鉴定【J 】郑州工程学院学 报，2 0 0 4 ，2 5 ( 4 ) ：6 2 斟 3 王小红，徐康，赵山，等孝感凤窝酒曲中酵母菌的分离及特性研 究 J 】现代食品科技，2 0 0 8 ，2 4 ( 2 ) ：1 3 4 1 3 7 4 王小红，王莹，赵山，等孝感风窝酒曲中根霉的分离及特性研究 f J l 中国酿造，2 0 0 8 ( 1 3 ) ：2 1 2 4 【5 】郭霞浓香型白酒酒糟微牛物分离及发酵试验【J 】重庆师范大学学 报：自然科学版，2 0 0 5 ，2 2 ( 1 ) ：5 0 5 2 【6 】李健容，蔡爱群民间传统酒曲主要微生物的分离及鉴定明酿酒科 技，2 0 0 7 ( 5 ) ；1 1 1 1 1 5 【7 】徐成勇，刘泉勇，郭波，等鼓香型白酒酒饼微生物的分离 食品 与发酵工业，2 0 0 2 ，2 8 ( 1 0 ) ：1 0 1 2 8 】周世水，熊建春酒曲中生香酵母的分离鉴定与产酯工艺优化田现 代食品科技，2 0 1 0 ，2 6 ( 1 ) ：9 8 9 9 【9 】刘洪伟茅台酒酒曲中5 株真菌的分离、纯化、鉴定初报 J 】酿酒， 2 0 0 9 ，3 6 ( 6 ) ：3 5 3 7 【l O 】萧暖章豉香型白酒酒曲中酵母分离、选育和鉴定【J _ 酿酒科技， 2 ( ) 4 ( 1 ) ：2 4 2 6 万方数据 研究报告 中国酿造 2 0 1 2 年第3 1 卷第2 期 总第2 3 9 期1 2 9 取代机制催化邻卤醇转化为环氧化物和卤化氢，该酶是微 生物降解此类化合物的关键酶之一。卤醇脱卤酶备受关注 的另一个原因是其在生物催化领域的应用，可以用来合成具 有光学纯的高价值中间体。因为环氧化物环具有非常活泼 的化学特性，易与亲核试剂发生反应生成一类重要的手性 合成单元不对称醇类。多种合成光学纯环氧化物的生 物学方法已被广泛研究。卤醇脱卤酶催化邻卤醇生成环氧 化物将成为高效合成光学纯的环氧化物的主要方法之一嘲。 E c 础P 8 4 A M C l 0 6 l 中含有卤醇脱卤酶外源基因的 质粒，在添加阿拉伯糖诱导后，可随菌体生长而在胞内表 达卤醇脱卤酶。为提高酶的产率，本文采用经优化后的发 酵产酶培养基，通过摇瓶发酵培养进一步优化E c 埘P 8 4 M C l 0 6 1 的产酶条件。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 菌种 重组大肠杆菌E c 鲥P 8 4 M C l 0 6 1 ，由安琪酵母股份 有限公司菌种室提供。 1 1 2 试剂 L - 5 可拉伯糖( L ( + ) 心a b i n o s e ) ，购于S i 舯a 公司。 酵母浸出物F M 8 1 8 ，由安琪酵母股份有限公司生产。 其他试剂均为分析纯A R 。 1 1 3 培养基 斜面培养基( 扎) ：甘油8 O ，酵母浸出物( F M 8 1 8 ) 2 5 ， N a C l6 0 ，K H 2 P 0 4 2 5 ，K 2 H P 0 4 2 5 ，N a 2 H P 0 4 5 0 ，M g S 0 4 7 H 2 0 1 O ，琼脂粉1 5 0 。 液体培养基( g L ) ：甘油8 O ，酵母抽提物2 5 ，N 16 0 ， K H 2 P 0 42 5 ，K 2 H P 0 4 2 5 ，N a 2 H P 0 4 5 0 ，M g S 0 4 7 H 2 01 0 。 1 1 4 诱导剂溶液( 以) L 广阿拉伯糖：浓度O 0 5 酌n L 。 1 2 主要测定方法 1 2 1 种子培养方法 种