圆红冬孢酵母α-亚麻酸高产菌株的选育.pdf

研究报告 中国酿造 2 0 1 2 年第3 1 卷第2 期 总第2 3 9 期 6 5 圆红冬孢酵母o 【一亚麻酸高产菌株的选育 代腾飞- ，胡申才k ，刘烨： ( 1 武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉4 3 0 0 2 3 ；2 武汉工业学院化学与环境工程学院，湖北武汉4 3 0 0 2 3 ) 摘要：利用L i C l 和紫外线诱变圆红冬孢酵母A s2 1 3 8 9 ，以红四氮唑( T T c ) 为显色剂通过9 6 孔板进行初筛；通过气相色谱( G C ) 进行 复筛，得到突变株D 2 。与原始菌株相比，D 2 的脂肪酸含量提高了7 2 ，a 亚麻酸( G L A ) 含量提高了2 5 9 ，达到0 5 0 8 9 几。经传代培养， 其0 L A 产量稳定。 关键词：圆红冬酵母：，v 亚麻酸；诱变；筛选 中图分类号：Q 9 3 3 3 1文献标识码：A文章编号：0 2 5 4 _ 5 0 7 1 ( 2 0 1 2 ) 0 2 一0 0 6 5 0 3 B r e e d i n go f 鼬o d o i 蝴幼u 枷船f o rh 诎I y i e l d 山h al m l e i ca c i 凼 D A IT e n g f e i l ，H US h e n c a i ，U UY e 2 ( i m s 垃t t l t co f B i o e n g 妇e 矗n ga l l dP h a m a c e u d c a lE n g 佃e 豳gw 曲a nP 0 1 ) 髓c h n i cm i v e f s 蛾w l m a n4 3 0 0 2 3 。C l l i n a ； 2c 0 船咿D f c 盎e 埘j 耐a d 勖v i r n 珊丑即纽j 勘勘鲫血强m 衄n 而撇缸L 撕咄螈w 劬衄4 3 弘叻删 A 妇t ：T h e 谢g i I 】a ls 蛐鼬o d 0 删击砌f o r U J 0 j 如A s 2 1 3 8 9 w a s 廿e a t e d b y L i c l a n d U V 1 1 1 e p r i r n a f ys c r e e n i n g w a Sc a r r i e d0 u t b y u 咖g T T C a sac o l o rr c a g c n tw 油9 6 嘶f i c ep l a I c ，a I l dt h es e c o n d a r ys c r e e i n gw a sd e t e c t e db yG cm e t h o d ，e V 髓t I l a l l yah i g h I y i e l d i n ga l p l l a l i n o l e n i ca c i d 舢t a n ts 昀i nD 2w o b t a 岫d T h er c s u l t ss h o w e d 曲tl h el i p i dc 0 丑劬to f m 咖t 咖i nw a s 沁r e a s e db y7 2 a n d 血ea l p h a - l i n o l e n j c 乳i dc o n t e n t 哪2 5 9t i I 懈h i 曲e rl 】1 a nt h a to f m eo r i g i n a ls 廿a i n ，讹c hw 鹪u pt oO 5 0 8 扎A 蛔s u b c u l 岫g ，m e8 6g e n e r a t i o nw a ss 衄b l eh e r e d i t ) ， K 咿啪r d s ：R h o d o s p 蒯岫加I f o d l 协；a l p h a _ l j n o I e I l i ca c i d ；m u t a n t ；o 。r e e n i n g 收稿日期：2 0 “0 9 - 0 8 基金项目：湖北省教育厅项目( Q 2 0 0 9 1 8 0 1 ) 作者简介：代腾飞( 1 9 8 6 ) ，男，硕士研究生，研究方向为生物转化；胡申才+ ，副教授，通讯作者。 时间为1 5 d 。醋醅中的含水量也影响发酵，水分大会阻碍醋 酸菌的氧化速度，水分小不适应醋酸菌繁殖。通过方差分 析( 表6 ) 可知，醋醅含水量、翻醅次数、发酵温度及发酵时 间均对固醋酸发酵工艺产生极显著影响值 F 矗。) 。 表6 醋酸发酵正交试验结果方差分析 T a b l e6 V a a n c ea n a I y s i sO fO r t h o g O n a It e s l sr e s u l t sf o ra c e t i c f e 丌T 1 e n t 龇i O n 2 4 产品品质的模糊评价 对以上9 个处理得到的产品的品质进行了模糊分析， V = ( 优，良，中，一般，差) ，做为评语来评价产品的影响 因素：色、香、味、体。颜色( 包括颜色是否符合产品特色、鲜 艳度、亮度、自然和谐度、宜人度等) 、香气( 包括香气突出、 持久、宜人、特色香气等) 、味道( 包括大曲香味突出、丰厚、 香味协调、留香持久，回味悠长等) 、体态( 包括特有体态、 原料物质特性、粘稠度、透明度等) 。评判小组由1 0 人组成 评判结果K 1 = 4 5 6 0 3 ；K 2 = 4 4 9 3 5 ；K 3 = 5 6 7 2 1 ；磁= 5 3 4 0 2 ； K 5 = 5 0 7 8 2 ；I ( 6 = 5 3 6 1 0 ；b = 4 9 8 3 9 ；k = 5 8 1 3 7 ；岛= 4 7 2 9 8 。 大于5 的处理的优先序是K 。 K 3 I ( 4 K 5 。也就是3 号 处理的品质最好，经检测，可溶性无盐固形物1 9 j 6 l 。 3 结论 由于搭载之后大曲微生物区系的改变，明显提高产品 中的无盐圆形物含量，搭载后的大曲生产的香醋味道更丰 厚，更宜人，远优于传统产品。在微生物学研究过程中，不 少微生物的形态发生了改变，特别是黑曲霉，有两株黑曲 霉分生孢子产生量较少，但孢子穗明显变大，菌丛也高大 茂盛，生长速度很快。综上所述，作者认为，通过航天大曲 可以用来生产香醋，且产品品质较好，把该产品称为航天 香醋。试验结果也表明，航天香醋酿造的最适工艺条件是： 在稀醪与酒精发酵时，活性干酵母添加量O 2 、航天大曲 添加量1 2 、醋酸菌添加量O 7 发酵温度3 2 ；固态发酵 时以醋醅含水量6 0 、翻醅次数为1 0 次、醅温控制在3 8 ， 固态发酵1 5 d 。航天香醋酸味柔和、丰厚、营养丰富，具有航 天大曲特有香气。 参考文献： 【1 张宗舟，谢亚萍太空搭载对大曲微生物区系的影响【J 】食品科学， 2 0 0 9 ( 3 ) ：2 1 4 2 1 6 2 】林祖申多菌种发酵是提高酱油、食醋质量的重要途径田中国酿造， 2 0 0 5 ( 6 ) ：1 5 【3 】上海市粮油公司技校上海市酿造科学研究所发酵调味品生产技术 咖北京：轻工业出版社，1 9 8 7 万方数据 2 0 1 2V O I 3 1N 0 2 6 6 S er i a | N o 2 3 9 C h i n aB r e w i n g R e s e a r c hR 印嘣 0 【亚麻酸( 1 i n 0 1 e n i ca c i d ，舭A ) ，全顺式9 ，1 2 ，1 5 十 八碳三烯酸，分子式为C ，8 H ，0 0 ：，在人体内能够转变为二十 碳五烯酸( E P A ) 和二十二碳六烯酸( D H A ) 。E P A 是体内三 烯前列腺素( P G I ，、T 蛐的前体物质，D H A 是大脑、视网 膜等神经系统磷脂的主要成分，其在机体的物质代谢和生 理调控上也发挥着十分重要的作用f l 】。研究发现，“亚麻酸 还具有多种药理作用；如具有抗心脑血管疾病和降血脂的 功效；降血压，抑制过敏；对一些肿瘤有明显的抑制作用， 对视觉功能和学习活动也有促进作用等【2 。 随着其保健功能和药用价值的开发，A L A 的市场需 求量急剧增加，这也激发了研究人员对如何获得A L A 进行 大量的研究。目前A L A 主要是通过从植物油、亚麻籽油中 提取获得，但A L A 高含量的亚麻籽油来源有限 3 。许多微生 物不饱和脂肪酸含量丰富，并且其发酵生产不受温度、季 节等条件的限制，因此可能成为生产A L A 的新来源。研究 发现圆红冬孢酵母能产生大量脂肪酸 4 】，本课题组还发现 该菌含有A I A 。 本文拟通过紫外和L i c l 复合诱变法选育出A L A 高产 突变菌株，为圆红冬孢酵母生产A L A 探索新的菌种资源， 也为寻找新的基因资源奠定基础。 1 实验材料和方法 1 1 菌种 圆红冬孢酵母( 鼬0 d o s p 嬲f 啪幼1 I J o j d e s ) A S 2 1 3 8 9 为 本校化学与环境工程学院刘烨老师赠送。 1 2 培养基 斜面培养基( Y E P D ) ：酵母提取物1 0 0 9 L ，蛋白胨 1 0 O g L ，葡萄糖2 0 0 9 ，L ，琼脂粉1 8 O g L ，p H5 5 。 液体种子培养基：Y E P D 。 液体发酵培养基：葡萄糖7 0 0 0 9 L ，Q 唧) 。S O 。2 o o g L ， N a 2 王口0 4O 4 4 9 L ，N a H 2 P 0 42 4 4 9 L ，M g s 0 41 0 0 9 L ，酵母粉 0 5 0 9 L 。 1 3L i c l 诱变浓度的确定和紫外线诱变条件的确定 ( 1 ) L i C l 浓度的确定 配制不同浓度梯度的L i c l P D 固体培养基，制备含 有L i C l 浓度梯度的Y E P D 平板，分别接入1 0 0 “L 相同的圆红 冬孢酵母孢子悬浮液，2 8 培养3 d ，计数，计算致死率，确 定其最佳浓度。 ( 2 ) 紫外诱变条件的确定嘲 将经紫外照射不同时问的圆红冬孢酵母孢子菌悬 液，取l o o “L 涂布于Y E P D 平板上，菌落计数，并计算致死 率，确定紫外线诱变条件。 1 4L i C l 和紫外线联合诱变法同 将Y E P D 斜面上圆红冬孢酵母用生理盐水洗脱孢子， 制成单孢子悬浮液( 1 0 e 个m 卜10 8 个m L ) ，在无菌操作下 倒入无菌培养皿中，在紫外灯下照射一段时间，分别取l m L 稀释到合适浓度，取0 1 m L 稀释涂布于含有L i C l 的平板上， 用黑布包好，2 8 避光培养3 d ，菌落计数，计算致死率，以 照射时间“) 为横坐标，致死率为纵坐标作图。 1 5 仪亚麻酸突变株的初筛方法 将突变菌株接入9 6 孔板中装有2 0 0 汕L 的发酵培养基， 2 8 、1 6 0 r m i n 培养2 d 。每孔加入8 0 斗LO 1 T T C ，避光摇 床振荡摇匀，观察颜色变化，在酶标仪上测定波长4 8 5 砌 处的吸光度值。 1 6 饯亚麻酸突变株的复筛方法 ( 1 ) 样品处理( 甲酯化) ：取O 3 9 菌体冻干粉，加入 O 5 m o 儿K O H C H p H ，6 0 水浴皂化3 0 m i ；冷却至室温， 加入1 4 B e F 3 C H 3 0 H ，催化3 1 1 1 i n ；加入l m L 正己烷川。 ( 2 ) 色谱条件：取正己烷层样品，采用A g i l e m 气相色谱 仪( H P 5 色谱柱) 进行检测，气化室温度为2 4 0 ，检测器温 度为2 6 0 ，分流比为1 0 。 ( 3 ) 脂肪酸总量的计算是通过发酵菌体，经过真空冷 冻干燥，利用索氏提取法提取油脂称重得到，A L A 的计算 是通过G C 图谱，用面积归一化法，结合得到的总脂肪酸的 量计算得到。 2 结果 2 1L i c l 浓度的确定，紫外线诱变的最佳条件 2 1 1L i c l