食品微生物快速检测方法优劣比较.pdf

2 0 13 年第3 期 ( 总第27 期) 质量技术监督研究 Q u a l i t ya n dT e c h n i c a lS u p e r v i s i o nR e s e a r c h N O 3 2 0 1 3 G e n e r a lN o 2 7 食品微生物快速检测方法优劣比较 谢雪钦 ( 厦门市产品质量监督检验院，福建厦门3 6 1 0 0 4 ) 摘要：食源性致病菌已成为当前威胁世界食品安全的关键因素，因此建立食品微生物全套快速检测方略对确 保食品质量、保障人类健康意义重大。文中从食品微生物检测的前处理、增菌、分离和富集以及检测各个环 节综述了国内外最新研究进展，为建立一体化、实时食品微生物检测平台提供一定的基础。 关键词：食品微生物；前处理；分离和富集：检测；全套快速解决方略 随着人们生活水平的日益提高及公众安全意 识的不断增强，食品安全作为一个关系国计民生 的重大世界性公共卫生问题也备受关注。在诸多 食品安全检测项目中，微生物污染是引发食源性 疾病的最主要因素。因此，建立快速、准确、灵 敏的现代微生物检测方法在食品安全监控中举足 轻重。鉴于此，文中结合当前食品微生物检测领 域的最新研究成果及进展，从样品前处理、增 菌、分离和浓缩到检测判定等各个环节综合解 析、探讨食品微生物快速检测的整套解决方略。 1 样品前处理 任何样品在进行微生物检测前均需经过称 量、均质和稀释等繁琐的前处理。上述工序不仅 耗时费力，且其处理效果将直接影响后续检测结 果的可靠性。因此寻求自动化、无污染的样品前 处理方案对提高食品微生物检测的时效性和准确 性意义重大。相对于传统人工操作模式及重复使 用的均质乳钵器和搅拌刀头，目前市场上出现品 类丰富的一次性均质袋、与样品隔离的拍打式均 质系统及自动化重量梯度稀释仪，不仅实现了样 品前处理的自动化、标准化及批量化，而且免除 了样品间的交叉污染。 2 增菌培养及分离 不论传统方法或现代检测技术，受检测灵敏 度的限制，食品样本经前处理后多需经过增菌培 养、选择性分离后方可用于后续检测分析。传统 微生物检测中上述两个步骤耗时长达2 4 - 9 6 h ，为整 个检测流程中的关键限速步骤。因此，建立高效 增菌策略以及靶标高度特异性微生物浓缩、分离 系统已成为实现微生物快速检测的核心。 收稿日期：2 0 1 3 0 l 1 4 作者简介：谢雪钦，女，厦门市产品质量监督检验院，工程师，博士 2 万方数据 2 1 增菌条件优化 为了缩短增菌时间、提高检测效率，国内外 许多研究者致力于致病菌选择性增菌条件改良。 如赵广英等 1 通过单因素筛选、正交试验设计优 化了水产品中副溶血性弧菌的增菌培养基及培养 条件，使其在相同培养时问内的菌液浓度达到国 标增菌方法的1 8 倍；相对于通用的耗时4 8 h 李氏增 菌肉汤L B l 和L B 2 两步增菌法，美国学者研发了一步 法o P S U 增菌肉汤，适用于巴氏杀菌奶和热狗等即食 类食品中单增李斯特菌的快速检测 2 l 。此外，为 了满足当前食品致病菌多重化检测的需求，在同 一体系内实现多种目标菌共增菌的富集培养基优 化也日益受到关注。f l N K i m 与B h u n i a 研制了针对沙 门氏菌、大肠杆菌0 1 5 7 ：H 7 及单增李斯特菌的复合 培养基S E L ，经多重P C R 及免疫法验证了其良好的复 合增菌效果 3 。国内研究者通过优化也分别获得 了可同时富集沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠 杆菌 4 或单增李斯特菌 5 的共增菌培养基，3 种致 病菌在优化条件下能以相对一致的速度增殖，增 菌液可满足下游多重P C R 检测要求，有效提高了检 测效率。 2 2 细菌分离与浓缩 近年来，国内外学者开发了多种食源性致病 菌的高效分离、浓缩法，基于其原理，主要可分 为包括离心、过滤等在内的物理法和赖于免疫反 应的吸附法。 2 2 1 密度梯度离心法 离心可将大体积样本中的细菌经沉淀而浓缩， 而后加入梯度密度的缓冲液，经多次的离心、洗涤 最终实现细菌与食品基质的分离。如刘道文等 6 利 用P e r c o l l 密度梯度离心法从鲜肉中高效分离沙门氏 菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌，去除P C R 反应抑 制因子，实现了3 种致病菌高灵敏度多重P C R 同步检 测。以1 3 种不同食品基质、1 2 种重要食源性致病菌 为材料，F u k u s h i m a 等 7 也证实了密度梯度离心法 能有效浓缩食品中的细菌达2 5 0 倍。 尽管离心法在细菌富集中具有一定的优势， 但其需经多次离心一洗涤反复循环而实现，耗时且 影响浓缩效率；另外，其浓缩对象为所有细菌， 缺乏靶标特异性。相对于此，基于抗原一抗体免疫 反应的吸附分离法则更显优势。 2 2 2 免疫磁分离技术 免疫磁分离技术( I n m m o m a g n e t i cs e p a r a t i o n ， I M S ) 是一种高效、特异性微生物富集技术。其原 理在于利用磁性微球表面偶联的抗体特异性地吸 附样品稀释液中的靶标菌，而后载有致病微生物 的磁性颗粒在外加磁场的作用下，向磁极方向聚 集，弃去检样混合液，使致病菌得到分离和富 集，从而大大缩短了常规检测所需的冗长的增菌 时间，提高检测效率。以其高度的靶标特异性及 与下游检测技术的良好兼容性，I M S 已在大肠杆菌 0 1 5 7 ：H 7 、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯 特菌以及耶尔森氏菌等重要食品微生物快速检测 中得到广泛应用l8 | 。 目前针对食源性致病菌富集的免疫磁珠及配 套分选仪市场主要被挪威的D y n a l 以及英国的 M atriX 两家公司占有，现均已被美国Life T e c h n o l o g y 收购为其旗下品牌。但进口磁珠价格昂 贵，且产品线不能完全覆盖我国现行食品微生物 检测标准中所涉及的所有致病菌，因此在一定程 度上限制了I M S 法在我国食品安全检测领域的应 用。针对此，近年来国内也有不少学者致力于捕 获各类致病菌的免疫磁珠的研发，已获得了靶向 于志贺菌、海洋弧菌以及小肠结肠炎耶尔森氏菌 等致病细菌的高效磁珠【9 | 。 3 快速检测技术 传统微生物检测方法包括形态观察、生化鉴 定及血清学分型等冗繁的操作，已不能满足现代 食品微生物检测对灵敏度、特异性和时效性的要 求。因此，在基因、蛋白或是代谢水平上，融汇 贯通生物学、物理学和化学等学科的最新技术， 开发新的现代检测方法已成为当今食品微生物检 测领域的一大热点。 3 1 分子生物学方法 此类方法在基因水平上对靶标微生物进行检 测，尤其适用于难培养或抗原结构复杂微生物的 3 万方数据 鉴定及分型，主要包括P C R 、核酸分子杂交及基因 芯片等技术。 3 1 1P C R 及其衍生技术 P C R 是一种体外酶促合成特定D N A 片段的技术， 它通过以变性、退火和延f 3 个步骤为一个周期的 循环反应实现产物的指数级增长。早在1 9 9 0 年代， P C R 以其高灵敏度、特异性及快速等特点已在微生 物检测中得到广泛应用 1o | 。近年来，随着常规P C R 的不断成熟，其衍生技术也被逐渐开发并应用于 微生物检测。 相对于扩增单一靶基因的常规P C R ，多重P C R 通 过在同一反应体系中加入多对特异性引物来实现 在同一反应管中同时扩增多个目标基因，可用于 同时检测多种微生物或通过多基因交叉确认来进 行特定微生物鉴定或种下分型。女N P a o l a 等E l i 3 针对 金黄色葡萄球菌的2 3 Sr R N A 、耐热核酸酶、血浆凝 固酶以及8 种肠毒素的编码基因分别设计特异引 物，建立多重P C R 方法鉴别乳制品中该菌产肠毒素 的类型；周蓓莉等 1 2 分别以沙门氏菌和单增李斯 特菌g y r B 基因和金黄色葡萄球菌C O a 基因作为靶标 设计3 对引物，通过优化反应体系，建立了能同时 快速地检测食品中3 种致病菌的三重P C R 法。 实时荧光定量P C R ( q u a n t i t a t i v er e a l t i m e P C R ，q R T P C R ) 技术是美国A p p l i e dB i o s y s t e m s 公 司于1 9 9 6 年推出的一种通过监颡 t J P C R 产物荧光信号 的实时累积来定性或定量分析起始模板的方法。 该法全程封闭式反应且无需P C R 后处理，避免了交 叉污染及溴化乙锭等有毒物质的使用，具有特异 性强、高度自动化等优点。通过选取特异性基因 设计引物及探针，q R T P C R 法近年来已在多种致病 细菌、霉菌、酵母以及乳酸菌等重要食品微生物 指标的定性和定量检测中被广泛应用 13 | 。许多研 究者还在此基础上进行方法改良，进一步提高检 测效率。如F u 等 1 4 3 发现结合I M S ，q R T P C R 法无需 前增菌即可准确、快速地检测大肠杆菌0 1 5 7 ：H 7 ， 有效缩短了检测周期；而张弛等 1 5 贝0 采用多色荧 光，建立了同步检测食品中3 种致病菌的T a q m a n 多 重荧光定量P C R 法。 4 尽管上述P C R 及其衍生技术具有高灵敏度、快 速等优点，但方法实施所需的昂贵仪器设备严重 限制了其在我国食品检测机构的推广应用。环介 导等温扩增技术( L o o p m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n ，L A M P ) 是由N o t o m i 等【1 6 J 于2 0 0 0 年 开发的一种无需扩增仪、结果可通过扩增副产物 的浊度直观判定的新型核酸扩增法。它通过高效 链置换技术，可在1 h 内于恒温条件下特异扩增D N A 达1 0 9 1 0 1 0 个拷贝。该法无需经历复杂变温循环扩 增过程，混样后仅需一个恒温反应器即可在短时 间内完成，较之其他P C R 法具有无以比拟的快速、 简便、高灵敏及直观等优点，因而在食品微生物 检测领域越发受到青睐 17 | 。2 0 1 1 年，我国也发布 并实施了针对出口食品中1 5 种致病菌的L A M P 检测方 法的出入境检验检疫行业标准S N T2 7 5 4 2 0 1 1 。 3 1 2 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交是利用带有标记的特定D N A 或R N A 探针与已变性的待检核酸样品进行杂交，若样品 中存在与探针互补的靶标序列则二者退火形成带 标记的双链，通过对标记物信号有无及强度的检 测即可实现微生物定性或定量分析。 分子杂交技术应用的关键在于靶标特异性核 酸片段选取及相应探针设计及标记。如以葡糖苷 酸酶基因设计核酸探针可用于检测食品中的总大 肠杆菌 18 | ，而其不同致病型的区分则需针对特异 毒力基因合成适宜的探针 1 9 。由于放射性标记存 在标记元素的半衰期短、对人体及环境不友好以 及需要特殊操作设备等缺陷，近年来已逐渐被非 放射性D N A 探针检测系统所取代，其主要通过酶促 反应将特定的底物转变为生色物质或化学发光物 质而达到信号放大的目的。 3 1 3 基因芯片 基因芯片又称D N A 微阵列，是一种高通量的核 酸分子杂交技术。它通过原位合成或显微打印将 一系列探针以预设的次序固定于固相支持介质表 面，形成高密度的寡核苷酸阵列，样品经核酸提 取、P C R 扩增及标记后与芯片上的探针阵列杂交， 最后通过荧光扫描或酶学方法检测杂交信号的强 万方数据 度和分布以确定受检样品中特定微生物的存在及 丰度。 食品中的微生物种群具有种类广、丰度低、 随机性强等特点，传统的培养、鉴定方法往往会 掩盖一些低丰度或不易培养的微生物，而P C R 、免 疫杂交等现代技术则多限于检测一种或少数几种 靶标微生物或基因，难以全面分析食品受污染状 况。而基因芯片具有高通量、并行化及高度自动 化等优点，为食品微生物群